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《江苏大学》 2010年
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低分子肝素体外抗人巨细胞病毒作用的实验研究

顾小海  
【摘要】: 目的: 采用人胚成纤维细胞(HF)培养技术,对低分子肝素(LMWH)体外抗人巨细胞病毒(HCMV)药物实验进行研究,探讨LMWH体外对HCMV的抑制作用。 方法: 1.测定HCMV AD169对HF细胞的毒力将病毒培养悬液用DMEM液按10倍递次法稀释成(10-1~10-8)的不同稀释度,每浓度设8复孔。向预先培养成单层的HF细胞加入不同浓度的HCMV液,同时设不加病毒的正常HF细胞对照组,置于37℃、5%CO2恒温箱内培养。逐日观察CPE,记录细胞的病变孔数,等细胞病变不再进行时,根据Reed-Muench法计算TCID50。CPE超过50%即(++)以上计为病变孔,(++)以下则计为非病变孔。 2.测定药物对HF细胞的毒性按倍比递次稀释法,将7种不同浓度的LMWH及阳性对照药物GCV分别加入已长成单层的HF细胞培养板中,每浓度设8复孔,同时设不加药物的正常HF细胞对照组。同样置于37℃、5%CO2恒温箱内培养。每日倒置显微镜下观察记录两种药物对HF细胞的病变效应,连续观察5-7d待细胞病变不再继续时,用MTT比色法测定A490值。使用Probit回归法分别计算出低分子肝素及阳性对照药物GCV对HF细胞的半数中毒浓度(TC50)。 3.药物体外对病毒增殖的抑制作用根据病毒复制周期,设计三种抗病毒作用方式来观察LMWH对HCMV的抑制作用。先用DMEM液将HCMV稀释成100TCID50/0.1ml备用。设立从TC0开始按倍比稀释成的7个浓度的LMWH组和GCV组,以及病毒对照组(Virus control group, VCG)与正常细胞对照组(Normal cell control group, NCG),各组均设4复孔。采用下列加药方式进行实验:1.增殖抑制法将HF细胞以病毒悬液吸附2h后,弃去病毒液后加入不同药物;2.感染阻断法HF细胞加药物培养2h,弃去含药物的维持液后加入HCMV感染;3.直接杀灭法药物与HCMV共同置于恒温箱中2h后再感染HF细胞,2h后更换成维持液培养。各实验组细胞继续置37℃、5%CO2恒温箱内培养,逐日倒置显微镜下观察记录CPE结果。待病毒对照组病变达+++~++++时,采用MTT比色法测定A490值。计算细胞存活率(CSR)和药物的病毒抑制率(IR),并使用Probit回归法求得两种药物对HCMV的半数抑制浓度(IC50)。结果: 1.将病毒原液行连续10倍递次稀释后,本实验测得HCMV AD169病毒株的TCID50=10-4.67/0.1ml。 2.用MTT比色法测定LMWH和GCV对HF细胞的TC0分别为2500mag/L,800 mag/L。计算出对HF细胞的TC50分别为2261.7 mg/L1685.23mg/L 3.三种不同药物加入方式下,方式1中GCV组能明显抑制HCMV所致CPE,方式2和3中LMWH能不同程度抑制HCMV所致CPE。方式I加药,各浓度GCV平均A490值与病毒对照组比较,均有统计学差异(P0.05),方式2和3中几乎各浓度平均A490值与病毒对照组比较,均无统计学差异(P0.05)。而对于LMWH而言,加药方式1中平均A490值与病毒对照组比较,均无统计学差异(P0.05),方式2和3中几乎各浓度LMWH的平均A490值与病毒对照组比较,均有统计学差异(P0.05或P0.01)。实验所设病毒对照组均可见典型CPE,正常细胞对照组均无明显病变。 4. MTT法测定正常细胞对照组及病毒对照组平均A490值分别为0.386±0.024和0.045±0.0021。三种药物加入方式下,方式1中GCV的IC50、TI分别为35.26mg/L和47.8。方式2和3中,LMWH的ICso、TI分别为2016.9 mg/L、1.12和555.46 mg/L、4.07。 5.以药物浓度为横坐标,病毒抑制率为纵坐标绘出不同药物加入方式下的剂量-效应关系图。方式1中GCV对HCMV的抑制作用随浓度升高而增强,存在明显的量效关系。而方式2和3中LMWH对HCMV的抑制存在部分量效关系。 结论: 1.体外实验的数据显示,低分子肝素具有抗HCMV作用,且随药物浓度的增高其作用增强,存在较明显的量效关系。 2.LMWH对HCMV无直接杀灭作用,但对HCMV的感染有一定的预防作用,可在体外从多个作用环节抑制HCMV感染。
【学位授予单位】:江苏大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R965

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