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《南京农业大学》 2011年
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香菇漆酶基因在毕赤酵母中的表达及对三苯甲烷类染料脱色的研究

周超  
【摘要】:漆酶是一类含铜的多酚氧化酶,一般含有4个铜原子,这4个铜离子处于漆酶的活性部位,在催化氧化反应中起决定作用。漆酶能催化氧分子4个电子还原成水,并且伴随着一些酚类和芳香类底物的氧化。它是白腐真菌三大木质素降解酶系统中的一种,由于其氧化底物时无需大量的H202作为辅助剂,且能把分子氧直接还原为水,不会造成二次污染的特点,使得它具有更大的潜在的工业价值,常被应用于环境有机污染物的降解、染料的脱色、造纸工业的漂白以及生物检测等领域。香菇作为一种白腐真菌,能够分泌出较多的漆酶,并对染料有脱色作用。但是香菇菌株在人工或者天然培养基上生长时漆酶合成水平仍然偏低,而且培养较为困难,发酵产物成分复杂,也不便于漆酶的大规模工业化制备。因此,开展真菌漆酶的基因克隆及在异源蛋白高效表达,是解决漆酶酶源短缺的重要途径。 根据基因库香菇漆酶基因LeLcc1的序列(登录号:AB035409),并以提取的香菇cDNA为模板,设计7对引物采用定点突变技术克隆漆酶基因,同时消除基因内部的BamH I和Sac I位点及5'端18个氨基酸组成的自身分泌信号肽序列,得到编码500个氨基酸的1503 bp漆酶基因序列,并插入到表达载体pPIC9K的多克隆位点中,构建得到重组质粒pYM8837。表达质粒含有酿酒酵母α信号肽序列、克隆的LeLcc1基因以及终止子。重组质粒以BglⅡ线性化后电转化进GS115菌株。SDS-PAGE分析显示重组漆酶分子量大小约为62 KD,糖基化率为15.4%。纯化后的重组漆酶以ABTS为底物进行酶学性质研究,结果表明重组漆酶在最适pH 2.4,在30℃条件下比较稳定,这与野生型漆酶性质(Lcc1)不同,但是在其它酶学性质方面相似。它们的最适温度是45℃,金属离子如Ba2+、Ca2+、Zn2+和A13+对它们的活性都有抑制作用,潜在的抑制剂如DTT和NaN3能强烈的抑制它们的活性,蛋白质螯合剂—EDTA对它们活性仅有微弱的抑制作用。L-Alanine作为重组漆酶在毕赤酵母表达时维持pH稳定的添加剂,具有促进漆酶酶活的作用。另外对重组漆酶摇瓶发酵条件进行了初步研究,为下一步大规模的发酵提供参考。结果表明BMM培养基最佳的诱导条件添加终浓度为1.5%甲醇和0.2 mM Cu2+。 我们研究了纯重组漆酶脱色孔雀石绿、结晶紫和亮绿,发现脱色效果不是很明显,且随着pH的上升染料脱色率在下降。ABTS是最常用的合成介体,我们对漆酶ABTS介体系统脱色染料条件进行了优化:孔雀石绿最佳的脱色条件是pH 2.4-3.0、温度是40℃和10μMABTS;结晶紫最佳脱色条件是pH 2.4-3.6、温度是45℃和10μMABTS;亮绿最佳脱色条件pH 3.0-4.0、温度是50℃和4μM。 我们以孔雀石绿为底物从8种自然酚类化合物中,筛选出乙酰丁香酮和丁香醛是最有效的介体,它们18h后几乎能将孔雀石绿完全脱色,结晶紫和亮绿的脱色率也达到65%。pH和介体浓度对染料的脱色有影响,孔雀石绿和结晶紫最适pH是4.0,而亮绿的最适pH是3.6;三种染料都是在介体/染料比例是6/1时达到最大脱色率。另外,HBT是一种最常见的漆酶合成介体,在本实验中发现对三种染料的脱色都没有起到介导作用。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:TQ925;S646.12

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【参考文献】
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