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《南京农业大学》 2011年
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氰氟草酯降解菌分离鉴定、降解特性的研究及氰氟草酯水解酶基因(chbH)的克隆和表达

聂志娟  
【摘要】:氰氟草酯(cyhalofop-buty1)是一种芳氧苯氧羧酸酯类除草剂,其在环境中的迁移、转化和分解等环境行为及其对人类健康的潜在危害正日益受到关注,分离筛选能降解氰氟草酯的微生物并研究其降解机制具有非常重要的理论和应用价值。 本文通过对长期受芳氧苯氧丙酸类除草剂污染的稻田土壤中进行富集筛选,分离到五株能降解氰氟草酯菌株,分别命名为QDZ-1, QDZ-A, QDZ-B, QDZ-C, QDZ-D经过形态、生理生化实验及16S rRNA基因序列分析,分别鉴定其属Pseudomonas sp. (QDZ-1), Agromyces sp. (QDZ-A), Stenotrophomonas sp. (QDZ-B), Aquamicrobium sp. (QDZ-C), Microbacterium sp. (QDZ-D).经过对降解效果进行比较,选择一株较高效氰氟草酯降解菌QDZ-1为研究对象,并对其生物学特性进行研究。 菌株QDZ-1无芽孢、革兰氏阴性、短杆状、一端生多根鞭毛。在LB固体平板培养两天后,菌落圆形、边缘光滑、呈黄色。能在15℃-37℃生长,最适生长温度为25℃-30℃,菌株QDZ-1在pH5.5-10.0范围内生长良好,当pH低于5.5菌株的生长明显受到抑制,最适pH值为7.0,好氧性生长,QDZ-1的最适生长NaCl浓度是0.5%,当NaCl浓度小于2.5%时,菌体生长良好,当NaCl浓度大于3.5%时,生长受到明显的抑制。 菌株QDZ-1能够以氰氟草酯为唯一碳源进行生长,经过5d的培养,降解率达到84.5%。菌株QDZ-1降解氰氟草酯的最适温度为30℃,最适pH为7.0。QDZ-1同样也能降解其他芳氧苯氧羧酸酯类除草剂,5d能降解68.9%的禾草灵,64.6%的精吡氟氯禾灵,92.6%的精喹禾灵,90.8%的精恶唑禾草灵和79.6%的精吡氟禾草灵。菌株和菌株的粗酶液能够在有农药(150 mg/L)的平板上产生水解圈。通过质谱机检测到QDZ-1以氰氟草酯为唯一碳源的液体基础盐培养基中代谢此农药时产生的代谢产物。在对代谢物结构的分析基础上推测了QDZ-1降解氰氟草酯的代谢途径。结果表明QDZ-1在降解氰氟草酯时,首先断裂其结构核心—酯键生成氰氟草酸,其次醚键断裂脱羧,最后氰基酰胺化。 通过构建基因组DNA文库,以氰氟草酯水解为氰氟草酸产生的透明水解圈作为氰氟草酯水解酶活力筛选标记,成功从菌株Pseudomonas sp.QDZ-1中克隆到一个新的氰氟草酯水解酶基因,命名为chbH。通过Omiga软件分析chbH具有996碱基得到编码332个氨基酸,分子量为36KDa。ChbH推测的氨基酸序列在NCBI的蛋白序列数据库中比对,结果表示chbH编码蛋白属于酯(脂肪)酶超家族。chbH编码蛋白与一些假设或推测性水解酶相似性最高;与Pseudomonas fluorescens的酯酶,82%的同源性;与Ralstonia eutropha H16的水解酶,50%的同源性;Burkholderia multivorans ATCC17616的α/β-水解酶,48%的同源性。以pET29a为表达载体,构建表达质粒pET29a-chbH,实现了ChbH蛋白在E. coli BL21 (DE3)中的融合表达,并用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白ChbH能水解多种芳氧苯氧丙酸酯类除草剂如精喹禾灵、精恶唑禾草灵、氰氟草酯、禾草灵和精吡氟氯禾灵。水解速率顺序为:精喹禾灵≈精恶唑禾草灵氰氟草酯禾草灵≈精吡氟氯禾灵。醇链长度严重影响芳氧苯氧丙酸酯类除草剂的生物降解,对具有相同的醇链长度的不同芳氧苯氧丙酸酯类除草剂拥有相似的降解效率,芳香烃上取代基对此类除草剂的生物降解影响很小
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:X172

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【参考文献】
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