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《南京农业大学》 2011年
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多菌灵降解菌的分离鉴定、生物学特性及多菌灵水解酶基因的克隆和表达研究

龚芬芬  
【摘要】:从长期施用多菌灵的土壤中分离得到两株多菌灵降解菌mbc-1和mbc-2,根据生理生化特征分析及16S rRNA基因相似性序列比较,分别将其鉴定为Mycobacterium sp. (GenBank Accession No.HQ873672)和Nocardioides sp. (GenBank Accession No.JF937914)。 菌株mbc-1和mbc-2在pH值为6.0~8.0,生长良好,最适pH均为7.0。mbc-1和mbc-2的最适生长温度均为30℃。mbc-1和mbc-2的最适生长碳源为葡萄糖,最适有机氮源均为酵母膏,mbc-1的最适无机氮源为硝酸钾,而mbc-2的最适无机氮源为尿素。 菌株mbc-1和mbc-2均能以多菌灵为唯一碳源生长,在多菌灵浓度为50mg-L-1的无机盐培养基中,mbc-1和mbc-2在84h之内对其降解率分别为97.9%和86.1%。mbc-1和mbc-2降解多菌灵的最适温度均为30℃,最适pH均为7.0。对菌株mbc-1和mbc-2代谢多菌灵途径的初步研究显示,它们首先将多菌灵转化为2-氨基苯并咪唑然后进一步转化为2-羟基苯并咪唑,直至完全降解。 根据已报道的多菌灵水解酶基因(mheI)设计引物,通过PCR的方法从mbc-1和mbc-2中克隆了该基因。序列测定和比对结果显示,它们与已报道的唯一的多菌灵水解酶基因mheI(Nocardioides sp. SG-4G, GQ454794.1)基因同源性均为99%。将该基因构建到表达载体pET29a上,转化到E.coli BL21(DE3)中进行了表达,得到了分子量符合预期大小的蛋白质(24.3KD),该蛋白具有多菌灵水解酶活性。 基于多菌灵水解酶基因序列在几株菌中高度保守,为了研究其是否和基因水平转移元件相连,我们通过染色体步移(chromosome walking)的方法,分别从mbc-1和mbc-2中获得了mhel基因上游和下游DNA片段,拼接后大小为5983bp和4529bp,其中mbc-1包括orfl (与alcohol dehydrogenase相似性最大,为57%),orf2(与L-asparaginaseⅡ相似性最大,为92%),orf3(与binding-protein dependent transport system inner membrane protein相似性最大,为96%),orf4(与ABC transporter-like protein相似性最大,为95%);mbc-2包括orfl(与L-asparaginaseⅡ相似性最大,为92%),orf2,orf3(与alcohol dehydrogenase相似性最大,为34%),orf4(与ABC transporter permease protein相似性为79%)orf5(与ABC transporter-like protein相似性最大,为95%)。现有结果没有发现和基因水平转移相关的证据,但是还有待进一步研究。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:X172

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