猪后肠产甲烷菌群多样性及其与乙酸生成关系的研究

【摘要】：产甲烷菌在单胃动物后肠的微生物发酵中起着重要的作用,其能利用微生物发酵产生的氢和二氧化碳生成甲烷,从而使后肠维持较低的氢气压,并促进有机物质的降解。迄今为止,国内外对猪后肠产甲烷菌的研究很少,为丰富人们对猪后肠产甲烷菌的理论认识,了解甲烷菌与乙酸还原菌在氢竞争中的关系；本研究以猪为试验动物,应用16SrRNA基因的克隆分析技术和RFLP分析技术相结合,研究了育肥猪粪便中产甲烷菌的多样性；利用DGGE技术研究了仔猪后肠中的产甲烷菌随时空变化的演变规律；利用体外发酵技术初步探究了仔猪后肠的产甲烷菌与乙酸还原菌的竞争关系。试验分为以下三个部分进行。 1猪后肠中产甲烷菌的多样性研究 采用产甲烷菌特异性引物Met86F/Met1340R,建立了猪粪便中的产甲烷古菌的克隆库。共挑取73个克隆,对所挑克隆进行限制性内切酶酶切分类,从分类单元中挑取两个克隆进行测序,所得序列与Genebank上相似序列比对结果显示,与Methanobrevibacter sp. WBY1相似的克隆占总克隆数的43.8%,与Methanosphaera stadtmanae相似的克隆占总克隆数的24.7%,余下克隆属于一类未知的产甲烷古菌,所占比例31.5%。结果说明,猪粪便中的优势菌为甲烷短杆菌属的Methanobrevibacter sp. WBY1,其次为一类未知的产甲烷古菌。 2猪结肠中甲烷菌群多样性的时空变化规律研究 利用基于16S rRNA基因的PCR-DGGE技术研究了仔猪从哺乳至断奶后结肠中产甲烷菌菌群的变化,对其图谱进行分析,并对其中优势条带进行了测序。DGGE图谱分析显示,断奶前后产甲烷菌群保持稳定；断奶后两周产甲烷菌条带明显增多。16S rRNA基因序列分析表明,这些条带主要属于甲烷杆菌纲和一类未知产甲烷菌。结果说明,日粮可能是影响产甲烷菌种群的主要因素。 3体外发酵法研究猪肠粪样中甲烷与乙酸生成的关系 采用体外批次培养技术,以猪粪便为接种物,研究了甲烷生成与乙酸产量间互作变化关系。试验分设对照组和处理组,BES的添加量分别为0、10、20 mM。结果表明,添加BES的浓度为20mM时,乙酸产量和丁酸显著高于对照组(P0.05)；添加BES的浓度为10mM时,乙酸产量和丁酸较对照组有所上升,但差异不显著(P0.05)。该结果揭示,添加BES可有效的抑制了甲烷的产生；抑制甲烷合成后,乙酸还原途径可能成为主要的氢利用途径。