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《南京农业大学》 2010年
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赭曲霉毒素A免疫检测方法的研究与呕吐毒素生物转化菌NJA-1的鉴定

张爱华  
【摘要】:真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物,广泛污染粮食和饲料等农副产品。自然界存在的真菌毒素种类繁多、毒性复杂,可引起人畜的急性、慢性中毒。赭曲霉毒素A(OTA)和呕吐毒素(VT)是影响农牧业经济发展和人类健康的两种重要毒素,而免疫学检测方法和生物转化去毒作为真菌毒素污染防控和去毒处理的主要手段,具有重要的研究意义。 酶联免疫吸附法(ELISA)作为免疫学检测方法的一种代表,具有比理化法更适于方便,比芯片法更经济的优点。真菌毒素的ELISA检测方法具有很好的应用市场。 单链抗体是一种基因工程抗体,它的基因稳定,容易保存不易丢失,而成为免疫检测技术发展的一个方向。单链抗体的研制,为其应用奠定基础。 生物转化是毒素去毒工作的重要手段,生物转化菌的认知是生物转化工作的重要组成部分。对已经分离获得的呕吐毒素的生物转化菌——NJA-1进行系统的生物分类鉴定和理化性质研究是十分有必要的。 因此,本试验开展了基于OTA单克隆抗体的间接竞争ELISA检测方法的研究,抗OTA的单链抗体的研制和呕吐毒素的生物转化菌NJA-1的分类鉴定工作。 试验Ⅰ赭曲霉毒素A单克隆抗体的研制 本试验分别用碳二亚胺法和活泼酯法两种方法合成OTA与钥孔戚血蓝蛋白(KLH),牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)三种载体蛋白的六种完全抗原,用紫外连续波谱扫描法对完全抗原进行测定,比较同一蛋白载体不同合成方法时OTA与蛋白偶联比差异,及同一方法不同蛋白载体时OTA与蛋白偶联比差异。免疫小鼠,以血清抗体滴度分析6种完全抗原的免疫原性差别。根据偶联比数据和小鼠免疫效果,探讨OTA完全抗原制备的最佳载体蛋白和偶联反应条件。活泼酯法制备的OTA-BSA免疫小鼠的脾细胞,与Sp2/0细胞融合,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,测定该抗体亚型并用SDS-PAGE对抗体进行验证。 结果显示:对同一蛋白载体,活泼酯合成法合成的完全抗原中OTA与蛋白的偶联比高于碳二亚胺合成法。而同一合成方法下,OTA与KLH的偶联比高于BSA.OVA。采用以KLH为OTA偶联载体通过活泼酯法合成OTA完全抗原偶联比最高,有利于增加OTA的免疫效果。通过细胞融合,筛选到4株分泌抗OTA抗体的杂交瘤细胞;对其中一株进行重点研究,命名该株细胞为D6D;获得的单克隆抗体亚型为IgG2b,轻链为K链。SDS-PAGE电泳呈现两条约为25 kD.50 kD的蛋白条带,符合IgG单克隆抗体变性后的蛋白质大小特征。 试验Ⅱ赭曲霉毒素A间接竞争酶联免疫检测法的建立 本试验对间接竞争酶联免疫检测法(ciELISA)的关键反应条件,包括抗原包被条件、抗原抗体反应条件、底物反应时间进行单因素优化,建立ciELISA的标准曲线。通过测试参试毒素OTB、AFB1、FB1和VT的IC50,计算交叉反应率以反映方法的特异性。通过向玉米空白样品分别加入2.5、5、10ng·g-1 OTA标准毒素,计算回收率和批内、批间变异率的添加回收试验测试该方法的准确度。应用本方法,对南京地区的大米、小麦、玉米等65份农产品中OTA含量进行测定。 结果显示:在抗原4℃包被过夜,抗原抗体37。C反应1h和底物作用10 min时,为OTA ciELISA检测方法的最佳反应条件。本方法的ICso为1.70 ng·mL-1,检测范围是0.55~6.75 ng·mL-1,检测限是0.15 ng·mL-1。本法与OTB的IC50是10 ng·mL-1,交叉反应抑制率是17%,而与VT、AFB1,FB1、的IC50均很高,交叉反应率均小于10%,揭示该方法对OTA的特异性良好。加标回收率在89.7~102.1%之间,批内变异率4%,批间变异率8%,具有良好的准确度和稳定性。南京地区的玉米、小麦、大米样品的检测显示,三种农作物的污染率为26.08%、36.36%、15.00%,平均含量分别为1.920、1.545、0.407 ng·g-1,其中有1个玉米样品OTA含量大于20 ng·g-1,2个样品OTA含量超过5 ng·g-1,64份样品OTA含量均低于我国对OTA的限量标准10 ng·g-1,63份样品OTA含量低于欧盟的农作物OTA限量标准,5 ng·g-1,显示南京地区的粮食的赭曲霉毒素A污染水平低,比较安全。 试验Ⅲ抗赭曲霉毒素A单链抗体的研制 本试验设计鼠源单克隆抗体的重链、轻链可变区基因引物。从D6D杂交瘤细胞总RNA中分别扩增抗体重链、轻链可变区基因,通过重叠延伸PCR法(soe-PCR)扩增鼠源单链抗体(ScFV)。构建pMD18-T-ScFV克隆载体,测序,构建pET-22b(+)-ScFV表达载体,并进行诱导表达。应用Expazy-prot软件预测ScFV蛋白的理化特性。 结果显示:扩增获得鼠源单克隆抗体的重链、轻链基因片段,分别约为300-400bp、200~300 bp。构建ScFV约为500~700 bp。测序结果显示该序列为609bp,编码203个氨基酸,包含重链和轻链各自的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FDR3,中间由15肽的linker相连。表达载体pET-22b(+)-ScFV在BL21(DE)原核系统以包涵体形式表达ScFV蛋白。经Expazy-prot软件预测分析,该ScFV蛋白的理化性质如下:分子量为21250.2;pI=7.85。在大肠埃希氏杆菌表达的半衰期大于10 h,是一种不稳定蛋白。 试验Ⅳ呕吐毒素生物转化菌NJA-1的鉴定 本试验通过传统形态学方法,包括菌落形态、菌株形态等鉴定呕吐毒素生物转化菌NJA-1。并应用真菌通用引物扩增真菌基因间隔区(ITS)序列,与NCBI基因库进行比对,进一步确定NJA-1的生物分类地位。基于察氏培养基,以氮源、碳源、培养基pH值、生长时间等培养条件为对象,研究其与菌丝干重的变化关系,优化NJA-1的培养条件。 结果显示:形态学方法观察该菌以分生孢子方式进行无性生殖,分生孢子头呈球形,褐黑色,顶囊膨大,顶囊上放射状密生着两轮小柄,分生孢子柄无色透明;分生孢子呈球形,褐黑色,表面不光滑,有小刺,常串生;菌丝有横隔。根据上述资料参考真菌形态分类相关著作,鉴定NJA-1为曲霉属黑曲霉群菌种。通过rDNA ITS序列的进化树分析NJA-1与曲霉属黑曲霉群的塔宾曲霉的亲缘关系大于99.7%,结合形态学分类结果,可以确定NJA-1为曲霉属黑曲霉群的塔宾曲霉。培养条件的优化显示,该菌在察氏培养基基础上,以葡萄糖为碳源,氯化铵为氮源,pH=4.0,培养10 d的生长状态最好。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R114

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【引证文献】
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8 朱文赫;重组导向毒素DLM表达、抗肿瘤活性及作用机制的初步研究[D];吉林大学;2011年
9 万海清;城市垃圾渗沥液—烟气脱硫体系中高浓度SO_4~(2-)的生物转化[D];四川大学;2004年
10 刘实忠;利用模式植物拟南芥鉴定和分离大丽轮枝菌外泌毒素中的致萎活性因子[D];中国农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张慧霞;棉花黄萎病菌致病力分化测定及其致萎毒素研究[D];西北农林科技大学;2008年
2 郑丙莲;粉纹夜蛾BTI-Tn-5B1细胞对苏云金芽孢杆菌cryIA(c)毒素的抗性选择及抗性机制的初步研究[D];华中师范大学;2001年
3 张利辉;玉米大斑病菌2号小种毒素的分离与纯化研究[D];河北农业大学;2001年
4 李萌;稻瘟菌粗毒素相关理化性质及致病机理研究[D];华中农业大学;2009年
5 钮利喜;工程菌生物转化D-型氨基酸的研究[D];山西大学;2004年
6 李瑞娟;球形红细菌生物转化槲寄生指纹图谱及化学成分的研究[D];山西医科大学;2010年
7 马丽艳;南瓜疫病菌(Phytophthora capsici Leon.)毒素致病机理及抗源筛选研究[D];东北农业大学;2003年
8 罗红丽;烟草赤星病菌(Alternaria alternata)AT-毒素的提取与毒性的生物测定[D];河南农业大学;2000年
9 鲍娜;雷氏大疣蛛毒蛋白分离纯化和生物活性测定[D];河北大学;2005年
10 魏伶俐;灰葡萄孢毒素的产生条件及其对番茄植株的致病作用[D];扬州大学;2007年
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