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《南京农业大学》 2010年
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镉胁迫下水稻和油菜中microRNA的克隆、鉴定与miR395功能分析

黄思齐  
【摘要】:microRNA (miRNA)是生物体内一类调控基因转录后表达的非编码的小分子RNAs (small RNA, sRNA).迄今为止,人们通过生物信息学和实验方法分离和鉴定到了大量的miRNA,并登录在miRNA数据库中(http://www.sanger.ac.uk/)。镉已经成为我国农田中有毒重金属污染的主要来源之一,它在植物中积累会破坏细胞功能,影响植物生长和发育。植物对重金属胁迫有不同的响应,其中很显著的就是,植物根系硫同化以及与谷胱甘肽代谢相关的基因表达上调。最近,越来越多的研究揭示了一些miRNA在各种非生物胁迫(如干旱、低温和机械力等)中的调控机制,然而对于不同物种中响应重金属胁迫的miRNA的研究甚少。 水稻(Oryza sativa)是世界一种非常重要的粮食作物,而且水稻的全基因组测序已经完成,这为我们挖掘到更多的与重金属胁迫相关的miRNA提供了基础。为了获得新的响应胁迫的miRNA,我们构建了一个经80μM CdCl2处理的水稻(日本晴)sRNA文库。在文库中一共克隆到19个新的miRNA,均属于水稻特有的miRNA,分属于6个不同的家族。我们还克隆到10个水稻已知的miRNA,其中9个为植物中保守序列,另1个属于水稻特有的miRNA。另外,在此文库中我们还发现56个不同的其它内源性非编码sRNA。对新发现miRNA进行了靶基因的预测后,得到了34个潜在的基因。进一步检测这6个新发现的miRNA家族和10个已知的miRNA在镉、铜、铝胁迫下的表达,发现他们有不同的表达模式。其中,miR602与其靶基因木葡聚糖内酰基转移酶(xyloglucan endotransglycosylase, XET)以及miR604与其靶基因脂质转运蛋白(lipid transfer protein, LTP)都存在负调控关系。这些功能有待于做进一步的鉴定。 油菜(Brassica napus)是世界第三大的油料作物。我们在油菜缺硫与重金属镉胁迫文库中克隆到5个新的保守miRNA,同时还克隆到2个与miR395相关的硫代谢响应基因BnAPS3 (FJ626851)和BnAPS4 (FJ626850).通过生物信息学和5’RACE实验方法确认了4个miR395的靶基因:BnSultr2;1,BnAPS1, BnAPS3和BnAPS4。此外,分析了miR395与其靶基因在缺硫胁迫和镉胁迫下的表达模式。镉胁迫和缺硫胁迫均能诱导miR395表达量增加,但其4个靶基因表现出不同的表达模式。将拟南芥395d前体转入到油菜之中,发现靶基因表达被抑制,其表皮毛缺失和发育延时等表型变化。 目前研究发现拟南芥中有6个miR395的位点,调控4个不同的与硫代谢相关的靶基因。为了深入研究miR395调控功能,我们构建了拟南芥miR395c和miR395e前体的过表达植株,再利用Slim突变体和Mimic395转基因植株分析了它们在正常和缺硫胁迫下的调控模式。在硫胁迫下,miR395表达量增加,ATPS1表达基本不变,ATPS4表达显著下调,SULTR2;1表达上升。相对于野生型Col-0,miR395过表达植株的靶基因表达量明显下降,而Mimic395转基因植株在两种条件下的表达均有所增加。为了揭示在缺硫胁迫下,SULTR2;1的表达与miR395表达同时增加的非负调控现象,我们构建了将SULTR2;1基因与其自身启动子和GFP蛋白融合(SULTR2;1PRO::SULTR2;1:GFP)的转基因植株。此外,我们还构建了SULTR2;1与miR395互补位点点突变的植株(SULTR2;1PRO::SULTR2;1mutant:GFP),通过检测这两种不同的转基因株系GFP荧光强度,表明miR395起到了抑制SULTR2;1过量表达的作用。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S511;S565.4

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