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《南京农业大学》 2011年
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草酸降解菌的分离鉴定及其对犬草酸钙尿结石的预防作用与机理研究

任志华  
【摘要】:据美国明尼苏达州结石分析中心报道,草酸钙结石在犬上的发病率已经从1981年的5%上升到了2007年的41%,而曾是犬发病率最高的磷酸铵镁结石的发病率则从1981年的78%下降到了2007年的40%。同时,草酸钙结石也是人发病率最高的结石类型。不同于其他类型的结石,草酸钙结石一旦形成,只能通过手术的方法来移除,给病犬和患者带来极大的痛苦。 犬和人草酸钙尿石症发病的原因之一是饮食中摄入过量的草酸而引发高草酸尿,进而导致病的发生。因而通过减少肠道中可被机体吸收的草酸的量,进而降低尿液草酸浓度,可预防草酸钙结石。近年研究发现,肠道中的一些乳酸菌具有降解草酸的能力,但研究还不够深入,相关分离鉴定和试验研究以应用于动物为目的的则更少见到。同时,由于肠道是一个复杂的环境,而乳酸菌并不以草酸为唯一碳源,因此,其他碳源对细菌利用草酸能力的影响值得研究。在之前的报道中,乳酸菌的草酸降解力都是单株研究,但是由于动物肠道菌群包括大约400多种已被鉴定的菌种,因此,混合菌株降解草酸的能力也值得被研究。 本研究对南京地区临床上犬尿石症的自然病例的发病情况进行了调查,对收集到的尿结石样品的成分进行了分析研究;建立了食源性草酸过多导致的犬高草酸尿、草酸钙结石模型;从不同品种的健康犬粪便中分离筛选了具有降解草酸能力的细菌,并对其进行鉴定;在体外研究了筛选出的降解草酸能力较强的乳酸菌草酸降解率和细菌量、糖浓度以及单株或混合株之间的关系;研究了草酸降解乳酸菌对酸和胆盐的耐受能力,对抗生素的敏感性,对小白鼠的急性毒性,在犬肠道的定殖以及对高草酸尿症模型犬的生物预防作用。这些研究可为研制预防犬和人草酸钙尿石症的微生物添加剂提供科学依据。各试验的研究内容如下: 试验1南京地区犬尿石症的发病情况调查 通过对收集的146例犬尿结石进行分析,了解南京地区犬尿石症的详细资料及尿石晶体化学成分构成。收集南京地区3家大型动物医院的犬结石标本146份,采用化学方法对尿石中的主要成分进行分析,同时对尿石症患犬进行流行病学调查。结果表明,146例尿石标本中,鸟粪石(磷酸铵镁)成分占52.55%(76/146),尿酸及尿酸盐占17.81%(26/146),磷酸钙占2.74%(4/146),草酸钙占23.29%(34/146),复合型结石占4.11%(6/146)。患尿石症犬的性别倾向、发病部位、品种趋势、平均年龄和饮食习惯对结石的成分及发生部位都有一定的关系。 试验2草酸降解菌的分离鉴定 本试验分别使用乳杆菌选择性培养基(MRS-万古霉素固体培养基)和肠球菌选择性培养基(Pfizer肠球菌选择性固体培养基),从3个品种共36条健康犬粪便中筛选细菌。经形态学观察、革兰氏染色、过氧化氢反应和草酸耐受试验,筛选出47株细菌革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、能够在含有20 mmol-L-1草酸的MRS固体培养基上生长的细菌,经分离纯化后,使用离子色谱法测定其在含有20 mmo1·L-1草酸的MRS液体培养基中降解草酸的能力,并使用法国梅里埃VITEK2全自动细菌分析仪进行鉴定。47株犬源草酸耐受乳酸菌包括22株乳杆菌、6株乳球菌、4株肠膜明串珠菌和15株肠球菌。24/47(51.63%)株乳酸菌具有降解草酸的能力。其中16株细菌的草酸降解力低于5%,而另外8株[肠膜样明串珠菌(RL75),格氏乳球菌(CD2),乳酸乳球菌乳酸亚种(CS21),屎肠球菌(CL71、CL72),粪肠球菌(CD14、CS62、CD12)]能够降解5%以上的草酸,和空白对照组相比差异显著(P0.05)。这8株细菌将用于下一步试验。 试验3不同糖浓度下细菌的草酸降解能力 观察了8株细菌在不同糖浓度MRS液体培养基中利用葡萄糖的情况,确定葡萄糖足够、不足、缺失的浓度分别为20 g·L-,2.5 g·L-’和0 g·L-1。调整8株细菌的新鲜菌液至1×106CFU-mL-1,按5%的接种量分别接种与三种不同糖浓度含量(足够、不足、缺失)的MRS-草酸液体培养基中,以测定他们草酸降解能力的变化。每个糖浓度都包括12个样品,分别是8株细菌的单个菌株、乳球菌混合菌株、肠球菌混合菌株以及所有细菌的混合株以及空白对照。和空白对照组相比,在三种糖浓度的情况下,所有菌株的草酸均显著降低(P0.05)。不同菌株在三个糖浓度下草酸降解率的变化各不相同。CL72的草酸降解率随葡萄糖浓度升高而显著升高(P0.05),RL75的草酸降解率在葡萄糖浓度为2.5 g·L-1时最高(P0.05),CS62、CD14、和CS21的草酸降解率在三种糖浓度下无差异(P0.05)。对于其他菌株,在20 g·L-1葡萄糖浓度的培养基中的草酸降解能率均高于葡萄糖浓度为2.5 g·L-1和0 g-L-1的培养基。所有细菌的混合株的草酸降解率强于单个菌株和其他两种混合菌株。各菌株的细菌量与葡萄糖浓度呈正相关(P0.05); CL72、CD12、CD14、CD2、乳球菌混合菌,所有菌混合菌的草酸降解率和细菌量呈正相关(P0.05), CL71、CS62、CS21、RL75、肠球菌混合菌的草酸降解率和细菌量无相关性。结果表明,葡萄糖对不同细菌的草酸代谢因菌株不同各异:一些细菌可以同时代谢葡萄糖和草酸,故当细菌量随葡萄糖浓度增大时,草酸降解率也增高;高浓度的葡萄糖可以抑制一些细菌草酸代谢。部分细菌的草酸降解率和细菌量正相关。不同种菌株混合后,有协同作用,草酸降解力强于单独菌株。RL75草酸降解力受其他碳源影响较大,另外7株细菌用于下一步试验。 试验4草酸降解菌体外及体内安全、定殖试验 本试验对筛选出来的7株犬源草酸降解菌的潜在益生作用做了进一步的评价,分别进行了耐酸试验、耐胆盐试验、抗生素敏感性试验、小白鼠急性毒性试验、犬体内定殖试验,并对进一步筛选出的两株细菌进行分子鉴定。将细菌以107CFU·mL-1分别接种于pH2.0、pH 3.0的MRS培养基后观察细菌的生长情况。结果表明,各菌株均能在pH 2.0的MRS培养基中耐受30 min,在pH3.0的MRS培养基中耐受4 h。其中,CL72在肠球菌中的耐酸能力较强,CS21在乳球菌中的耐酸能力较强。将细菌以107CFU·mL-1分别接种于0.3%、1%胆盐的MRS培养基后观察细菌的生长情况。各菌株均能耐受0.3%胆盐24 h,能耐受1%胆盐12 h。肠球菌耐受胆盐能力均较好。虽然各菌株耐药谱不同,但各菌株均对青霉素类、氟喹诺酮类、利福平、糖肽类、硝基呋喃类敏感。140只清洁级昆明小鼠随机分为7组,雌雄各半。将7株细菌冻干粉以101。CFU·g-,15 g·Kg-’的剂量给小鼠灌胃给药,灌胃2次,两周后观察未见小白鼠死亡表明细菌对小白鼠无急性毒性。将细菌驯化为耐受利福平的细菌,确定试验犬体内没有耐利福平的细菌后,每天补给5 mL 109CFU·mL-1草酸高效降解菌的耐利福平菌株,时间为10 d。结果表明,在饲喂第1d就能在犬粪便中分离到各菌株,且停止饲喂后,第20 d仍能在犬粪便中分离到各菌株。各菌株饲喂1d、5d、10d时细菌量差异不显著(P0.05),停止饲喂后,15 d,20 d时细菌量差异显著(P0.05)。结合细菌草酸降解能力及各试验结果,筛选出CL72和CS21做分子鉴定,使用16srRNA通用引物对两株细菌的16srRNA基因扩增并测序,将获得的序列输入数据库(GenBank+EMBL+DDBJ+PDB),登录号分别为JF895185, JF895186,与现有序列比对并制作分子进化树后,发现其分别与屎肠球菌、乳酸乳球菌乳酸亚种的相似性均为99%,与全自动细菌鉴定仪的鉴定结果一致。这两株细菌将用于下一步试验。 试验5食源性草酸过多草酸钙结石动物造模 采用0.5%和1%两种不同浓度草酸诱导犬肾草酸钙结石模型,检测0 d,15 d,30d各组犬24 h尿总钙和尿草酸,尿尿素氮,尿肌酐,血钙,血尿素氮和血肌酐,以比较这两种试验性犬食源性草酸摄入过多肾草酸钙结石模型。结果发现:在饲料中添加草酸后,1%草酸组的尿比重在第15d就显著增高(P0.05),0.5%草酸组的尿比重在第30 d显著增高(P0.05)。0.5%和1%试验组的犬,试验第15d尿液pH值均显著减小(P0.05)。试验第15d及第30 d,0.5%和1%草酸组的血清钙较空白对照组均有显著降低(P0.05),且1%草酸组的血清钙较0.5%组的血清钙降低的更显著(P0.05)。相较于空白对照组,在整个试验期间,0.5%草酸组的血清肌酐和血清尿素氮均有升高,但差异不显著(P0.05)。而1%草酸组的血清肌酐和血清尿素氮相较于另外两组,在饲喂草酸15d后,就有显著升高(P0.05)。试验第15 d,1%草酸组的尿钙较空白对照组和0.5%草酸组的尿钙显著升高(P0.05),试验第30d,0.5%草酸组的尿钙和1%草酸组的尿钙较空白对照组均显著升高(p0.05),且1%草酸组的尿钙高于0.5%草酸组的尿钙(P0.05)。试验第15d、30d,0.5%草酸组的尿草酸和1%草酸组的尿草酸较空白对照组均显著升高(P0.05),且1%草酸组的尿草酸均显著高于0.5%草酸组的尿草酸(P0.05)。试验第15 d,0.5%草酸组和1%草酸组的尿肌酐和尿尿素氮均无显著变化;试验第30 d,1%草酸组的尿肌酐和尿尿素氮显著高于空白对照组和0.5%草酸组(P0.05)。1%组结晶成堆而且连接,上皮细胞明显肿胀、变性、坏死,管腔扩张明显。0.5%组仅有少数结晶分布,管腔内仅见散在草酸钙结晶,管腔扩大也较轻。 试验6草酸降解菌在犬体内的草酸降解能力 研究了草酸降解菌在体内降解草酸的能力。本地犬30条,分为5组,分别为空白对照组、0.5%草酸阳性对照组、0.5%草酸+屎肠球菌(CL72)组、0.5%草酸+乳酸乳球菌乳酸亚种(CS21)组、0.5%草酸+两株细菌的混合菌株组。细菌能够降低试验犬的尿比重,但差异不显著(P0.05);在试验第15d和第30 d,CL72和混菌的能够预防尿液pH值显著降低(P0.05)。CL72和混菌在试验第15d和试验第30 d均能显著降低尿液草酸浓度(P0.05),CS21也能降低尿液草酸浓度,但差异不显著(P0.05)CL72和混菌在试验第15d和试验第30 d均能显著降低尿液草酸浓度(P0.05),CS21也能降低尿液草酸浓度,但差异不显著(P0.05)。三个试验组均能够防止血液肌酐和尿素氮的升高,同时防止尿液肌酐和尿素氮的降低,但是均不显著(P0.05)。在试验第30 d时,草酸降解菌能够防止血钙浓度的下降,但差异不显著(P0.05)。在试验第30 d时,草酸降解菌能够显著降低尿钙水平,且差异显著(P0.05)。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R691.4

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中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 任志华;草酸降解菌的分离鉴定及其对犬草酸钙尿结石的预防作用与机理研究[D];南京农业大学;2011年
2 李霞;微量热法研究生物大分子及草酸钙模拟生物矿化[D];武汉大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王淼;降解海藻多糖对草酸钙生长、聚集和晶面的影响[D];暨南大学;2009年
2 邓兰青;聚合物对草酸钙尿路结石的调控作用[D];暨南大学;2006年
3 姚秀琼;不同模拟体系中草酸钙晶体的结晶及其对尿结石的化学模拟[D];暨南大学;2002年
4 段荔;不同种类羧酸及其盐对尿石矿物草酸钙生长的影响[D];暨南大学;2004年
5 陶菲;草酸钙结晶过程的部分影响因素研究[D];武汉理工大学;2013年
6 蔡然;肾细胞缺血缺氧对于草酸钙代谢及其结晶体附着部位影响的研究[D];青岛大学;2013年
7 鲁鹏;大豆多糖对草酸钙晶体生长的调控作用[D];暨南大学;2010年
8 谢蓉;纳米草酸钙的稳定性及其生长动力学研究[D];暨南大学;2010年
9 袁欢欣;不同结构氨羧钾影响草酸钙结晶的化学基础[D];暨南大学;2006年
10 朱军;草酸钙型尿结石的体外模拟与抑制[D];安徽大学;2005年
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