番茄枯萎病和梨轮纹病生防菌控病机制研究及几丁质酶基因的克隆与表达
【摘要】：由尖孢镰刀菌番茄专化型[Fusarium oxysporum f.sp.licopersici (sacc) snyderet Hansen]引起的番茄枯萎病和贝伦格葡萄座腔菌梨生专化型Botryosphaeria berengeriana de. Not. f.sp. piricola (Nose)引起的梨轮纹病全国普遍发生。生物防治植物病害能降低农产品表面化学杀菌剂的残留量,保护生态环境和人类健康。
我们采集不同地区样本,以两种病原菌为靶标菌,分离、筛选对枯萎病菌或轮纹病菌具有很强拮抗作用的菌株,进行种属鉴定。初步研究拮抗细菌产生的抑菌物质及控病促生作用机制,克隆生防相关基因-几丁质酶基因。同时还研究了拮抗菌株之间互作、微生物-化学物质(杀菌剂、NaHCO3)协同作用与防效之间的相关性。研究结果表明：
1、22株拮抗细菌对番茄枯萎病菌具有较强的室内抑制作用,其中菌株PTS-394、H-70、L-1和SJ-280抑制率最高；22株细菌均能分泌蛋白酶；其中菌株C8-8能分泌几丁质酶；有3株细菌能分泌纤维素酶；3株细菌能分泌嗜铁素。盆栽试验结果表明：拮抗细菌PTS-394对番茄枯萎病的防效最高,为77.40%；菌株H-70、L-1和SJ-280对番茄枯萎病的防效均大于60%。对上述四株拮抗细菌进行16s rRNA种属鉴定,均为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).
2、利用PCR方法从菌株C8-8中克隆到编码几丁质酶的chiA基因。同源性比对发现该基因序列与粘质沙雷氏菌的chiA有97%以上的相似性。酶切后连接到质粒28a中,并转化大肠杆菌DH5α,扩增培养后提取质粒28a(chiA)并转入到表达宿主大肠杆菌DH3中。DH3ChiA菌株在几丁质培养基上能产生透明的水解圈,具有几丁质酶活性,超声波破碎后SDS-PAGE电泳显示为一条相对分子质量约为60KDa的蛋白质,该蛋白具有较强的室内抑菌活性。
3、拮抗细菌C8-8的最适培养温度为30℃-35℃、最适培养pH值为7.0-8.0。培养时间、初始接种量对菌株C8-8的生长有明显的影响,培养27h后菌液OD值最高；最佳初始接种量应是被接种培养液体积的0.5-1/300。不同通气量对菌株生长无明显影响。不同培养条件(碳源、氮源、诱导物、温度、时间和pH值)下菌株C8-8产几丁质酶的活力差别较大。N-乙酰氨基葡萄糖能完全抑制菌株C8-8产酶；酵母粉和蛋白胨能使菌株C8-8酶活力明显提高；胶体几丁质能诱导菌株C8-8产酶。培养温度为31℃,pH值为7.3,培养6天时菌株C8-8的酶活最高,为485μg GlcNAc·h-1。
4、接种菌株C8-8能诱导番茄植株产生抗性效应,提高植株体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(POD)的酶活性；而且还有利于积累活性氧,进一步激发寄主抗性。采用高效液相色谱HPLC对菌株C8-8代谢产物分析表明：该菌株C8-8在NA培养基中的代谢产物内存在大量的产生GA3,推测可能和促生作用相关,培养2d后产生的GA3为158mg/1,而IAA未测出。在基本培养基中该菌株代谢产物未检测出IAA和GA3。
5、拮抗细菌之间存在多种互作关系。当混合的2个菌株之间互作关系是亲和的,其生防效果有所提高,如亲和性菌株组合SJ-280+PTS394对番茄枯萎病的防效为47.1%,明显好于单菌株SJ-280(35.3%)和PTS394(38.7%)的防效。当混合的2个菌株之间互作关系是不亲和的,有的菌株组合生防效果下降,如不亲和性菌株组合C8-8+PTS394的防效为23.5%,明显低于单菌株C8-8(52.8%)和PTS394(38.7%)的防效；有的菌株组合生防效果提高,如不亲和性菌株组合L-1+PTS394的防效为50.0%,明显好于单菌株L-1(29.4%)和PTS394(38.7%)的防效。
6、分离样本,获得21株对梨轮纹病菌菌丝生长有较强的拮抗能力的菌株,其中拮抗性能最好的细菌sf 628抑菌圈直径达45mm,抑制率达59.21%。梨果接种试验结果表明：21株拮抗能力较强的细菌中有5株拮抗细菌对梨轮纹病菌引起的病斑扩展抑制率大于50%,其中菌株sf 628抑制率达60.61%。进一步的理化特性和分子鉴定结果表明,菌株sf628为枯草芽孢杆菌枯草亚种。
7、常见26种化学药剂对梨轮纹病菌的室内毒力测定结果表明：25%敌力脱能有效抑制梨轮纹病菌菌丝生长,ECso值为0.1522μg/ml。将拮抗细菌sf628与25%敌力脱进行复配,结果表明配比为1：3、1：2、1：1、2：1时增效比均大于1.5,表明有增效作用。其中配比为1：3时对梨轮纹病菌的毒力最强,增效比为2.942。拮抗细菌sf628与25%敌力脱配比为3：1时,增效比为1.071,表明两种单剂复配后有相加作用。
8、室内抑菌试验结果表明：生防菌单剂对梨轮纹病菌的防效为75.77-85.41%；与NaHCO3协同作用后防效提高,为83.00-90.23%。以生防菌11为例,梨果试验结果表明：先接种病菌再喷施生防菌时,对梨轮纹病的防效为23.83%；与NaHCO3协同作用后防效提高,为48.16-74.57%。先喷施生防菌再接种病菌时,对梨轮纹病的防效为28.72%；与NaHCO3协同作用后防效明显提高,为51.06-80.91%。
【关键词】：拮抗细菌 番茄枯萎病 梨轮纹病 生物防治 基因克隆
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：S436.412;S436.612
【目录】：
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：S436.412;S436.612
【目录】：
- 目录4-9
- 摘要9-11
- ABSTRACT11-14
- 上篇14-51
- 第一章 植物病害生物防治的研究进展15-37
- 1 生防因子的种类16-20
- 1.1 生防细菌16-18
- 1.2 生防真菌18-20
- 2 控病机理20-27
- 2.1 与病原菌竞争营养和空间位点20-22
- 2.2 分泌抗菌物质22-25
- 2.3 溶菌作用25-26
- 2.4 诱导抗性作用26
- 2.5 重寄生作用26-27
- 3 目前生物防治中存在的问题及其展望27-29
- 3.1 生防菌在植物病害防治中存在的问题27
- 3.2 问题的对策27-28
- 3.3 展望28-29
- 参考文献29-37
- 第二章 几丁质酶的研究进展37-51
- 1 几丁质酶的分布37-38
- 1.1 微生物几丁质酶37-38
- 1.2 动物几丁质酶38
- 1.3 植物几丁质酶38
- 2 几丁质酶的种类和特性38-40
- 2.1 几丁质酶的种类38-39
- 2.2 几丁质酶的性质39-40
- 3 几丁质酶的基因克隆40-42
- 3.1 微生物几丁质酶的克隆40-41
- 3.2 植物几丁质酶的克隆41-42
- 4 几丁质酶的应用42-45
- 4.1 植物几丁质酶的基因工程42-44
- 4.2 微生物几丁质酶转入植物的基因工程44-45
- 5 问题和展望45-46
- 参考文献46-51
- 下篇51-139
- 第一章 番茄枯萎病拮抗细菌的筛选、评价和种属鉴定53-65
- 1 材料与方法54-56
- 1.1 试验材料54
- 1.2 试验方法54-56
- 2. 结果分析56-61
- 2.1 细菌分离物对枯萎病菌的抑制作用56-58
- 2.2 22株拮抗细菌的产酶和代谢物活性测定58-60
- 2.3 拮抗细菌对番茄枯萎病的盆栽防治试验60
- 2.4 拮抗细菌种属的鉴定60-61
- 3 讨论61-63
- 本章小结63-64
- 参考文献64-65
- 第二章 拮抗细菌C8-8几丁质酶基因的克隆与表达65-75
- 1 材料与方法66-67
- 1.1 试验材料66
- 1.2 试验方法66-67
- 2 结果分析67-71
- 2.1 菌株C8-8产酶活性测定67-68
- 2.2 菌株C8-8对几种病原菌的室内抑制作用68
- 2.3 菌株C8-8的控病促生作用研究68-69
- 2.4 几丁质酶基因的扩增、克隆和测序69-70
- 2.5 ChiA蛋白的表达和SDS-PAGE电泳70-71
- 3 讨论71-72
- 本章小结72-73
- 参考文献73-75
- 第三章 拮抗细菌C8-8控病促生机理研究75-101
- 第一节 拮抗细菌C8-8生长条件和产酶条件的研究75-85
- 1 材料与方法76-78
- 1.1 试验材料76
- 1.2 试验方法76-78
- 2 结果分析78-83
- 2.1 拮抗细菌C8-8在不同温度、pH值下的生长情况78
- 2.2 拮抗细菌C8-8的生长曲线78-79
- 2.3 不同接种量对菌株C8-8的影响结果79
- 2.4 不同通气量对菌株C8-8的影响结果79-80
- 2.5 N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线的建立80
- 2.6 不同碳源、氮源和诱导物对菌株C8-8产几丁质酶的影响80-82
- 2.7 不同培养温度、pH和时间对菌株C8-8产几丁质酶的影响82-83
- 3 讨论83-85
- 第二节 拮抗细菌C8-8控病促生作用机制研究85-91
- 1 材料与方法86-88
- 1.1 试验材料86
- 1.2 试验方法86-88
- 2 结果分析88-90
- 2.1 PAL和POD活性变化88
- 2.2 CAT和APX活性变化88-89
- 2.3 植物生长激素的HPLC定性和定量结果89-90
- 3 讨论90-91
- 第三节 拮抗细菌菌株之间的互作关系及其对生物防治效果的影响91-98
- 1 材料与方法92-93
- 1.1 试验材料92
- 1.2 试验方法92-93
- 2 结果与分析93-97
- 2.1 拮抗细菌菌株之间亲和性的测定93-94
- 2.2 混合拮抗菌株对枯萎病菌菌丝生长的抑制作用94-95
- 2.3 混合拮抗菌株对茄科蔬菜枯萎病的控病作用(盆栽试验)95-96
- 2.4 混合拮抗菌株对茄科蔬菜枯萎病防治效果(田间小区试验)96-97
- 3 讨论97-98
- 本章小结98-99
- 参考文献99-101
- 第四章 梨轮纹病拮抗细菌的筛选与评价101-113
- 1 材料与方法102-103
- 1.1 试验材料102
- 1.2 试验方法102-103
- 2 结果分析103-110
- 2.1 拮抗细菌的分离与筛选103-104
- 2.2 拮抗细菌的对梨轮纹病的梨果活体防效104-106
- 2.3 拮抗细菌sf628种的鉴定106-110
- 3 讨论110-111
- 本章小结111-112
- 参考文献112-113
- 第五章 微生物-化学协同作用防治梨轮纹病113-139
- 第一节 生防菌和化学药剂敌力脱协同作用防治梨轮纹病113-122
- 1 材料与方法114-117
- 1.1 试验材料114
- 1.2 试验方法114-117
- 2 结果分析117-120
- 2.1 病原菌分离、鉴定与致病性分化测定117-118
- 2.2 拮抗细菌的分离与筛选118
- 2.3 常见化学药剂对梨轮纹病菌的毒力测定118-120
- 2.4 化学药剂与拮抗菌复配结果120
- 3 讨论120-122
- 第二节 生防菌和NAHCO_3协同作用防治采后梨轮纹病122-134
- 1 材料与方法123-126
- 1.1 试验材料123-124
- 1.2 试验方法124-126
- 2 结果分析126-132
- 2.1 培养基pH值对病原菌和生防菌菌丝生长的影响126-127
- 2.2 病原菌、生防菌和NaHCO_3的相容性测试127-128
- 2.3 生防菌和NaHCO_3协同作用对梨轮纹病菌菌丝生长的室内抑制作用128-131
- 2.4 生防菌和NaHCO_3协同作用对梨轮纹病的防效131-132
- 3 讨论132-134
- 本章小结134-135
- 参考文献135-139
- 全文总结139-141
- 本论文创新点141-143
- 主持相关课题143-145
- 发表的论文145-147
- 致谢147
| 【参考文献】 | ||
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| 【共引文献】 | ||
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| 【二级参考文献】 | ||
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| 【相似文献】 | ||
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