发芽糙米富硒特性及其硒蛋白抗氧化与抗肿瘤活性研究
【摘要】：本文对糙米发芽富硒特性及富硒发芽糙米硒蛋白的分离纯化及其抗氧化与抗肿瘤活性进行了系统研究。对适宜发芽富硒的糙米品种筛选及其培养条件优化、硒元素与发芽糙米生理变化和主要营养物质动员的关系、硒在富硒发芽糙米部位和蛋白质中的分布进行了研究,并对富硒发芽糙米硒蛋白进行了分离纯化和鉴定,考察了主要硒蛋白的体外抗氧化和抗肿瘤活性。主要研究结果如下：
1、在培养液中添加Na2SeO4或Na2SeO3均可显著提高发芽糙米对总硒及蛋白结合硒的富集,Na2SeO4或Na2SeO3浓度与糙米发芽率及芽长密切相关,当其添加量小于60μmol/L时,对发芽率及芽长均无显著影响(P0.05),浓度继续升高则产生显著抑制作用(P0.05);用Na2SeO4和Na2SeO3溶液培养时,发芽糙米中硒富集量分别呈Michaelis-Menten趋势(R2=0.974,P0.01)和直线趋势(R2=0.985,P0.01)增加,表明发芽糙米对Na2SeO4和Na2SeO3具有不同的富集方式与途径；糙米对Na2SeO3的富集与转化能力高于Na2SeO4;不同品种糙米对硒的富集和转化能力差异达极显著水平(P0.01),在10种糙米品种中,Z8和X57具有较强的富硒和转化能力；在培养温度为20-30℃、培养时间2-4 d、Na2SeO3浓度30-90μmpl/L范围内,采用Box-Behnken实验设计优化得最优培养条件为：培养温度26℃、培养时间4 d、Na2SeO3浓度52μmol/L,在此条件下所得富硒发芽糙米中总硒含量为9.19μg/g,蛋白结合硒比率为54.21%。
2、探讨了硒与发芽糙米生理变化和主要贮藏物质动员的关系。硒浓度小于60μmol/L时对发芽糙米呼吸强度无显著影响；当浓度为90μmol/L时,Z8和X57两种发芽糙米呼吸强度分别比对照下降19.7%和22.6%；硒添加量为0-90μmol/L时,对发芽糙米干物质损失率无显著影响；高浓度的硒对糙米生长产生抑制作用,阻碍淀粉的降解,还原糖含量减少。用90μmol/L的硒培养后,Z8和X57中淀粉含量分别比对照提高9.53%和8.26%,而还原糖含量分别比对照下降13.47%和19.37%;当硒添加浓度在10-60μmol/L范围内时,对淀粉及还原糖含量均无显著影响(P0.05)；发芽糙米可溶性蛋白质含量与硒浓度呈负相关,90μmol/L的硒对其产生抑制作用,Z8和X57分别比对照下降19.38%和16.72%；游离氨基酸含量随硒浓度的增加呈先增加后下降的趋势,在10μmol/L具有最大值,Z8和X57分别比对照提高12.80%和14.82%,而用90μmol/L的硒培养时,游离氨基酸含量分别比对照下降9.02%和12.72%；发芽糙米蛋白酶包含多种同工酶,低浓度硒可显著提高蛋白酶活性,浓度过高对其产生抑制作用；GSH-Px活性变化规律与蛋白酶活性变化相同。
3、硒在富硒发芽糙米组织部位和蛋白质组分中的分布呈现不均衡性。发芽糙米的米芽中硒浓度最高,从外部米糠层向内胚乳层呈逐渐递减规律；约40-50%的硒分布于占发芽糙米重量10-15%的米芽、米糠层和外胚乳中；富硒发芽糙米清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量变化趋势与发芽时间和硒处理浓度有关。除醇溶蛋白外,糙米发芽后各蛋白组分含量均显著下降,但清蛋白和球蛋白降解先于谷蛋白；当硒浓度在0-90μmol/L范围内时,各处理浓度对发芽糙米谷蛋白和醇溶蛋白含量均无显著影响,但低浓度的硒可促进发芽糙米清蛋白和球蛋白的降解；四种蛋白组分中均结合有不同程度的硒,但各蛋白组分对硒的富集及转化能力差异显著,总硒和蛋白结合硒含量顺序为清蛋白谷蛋白球蛋白醇溶蛋白；虽然清蛋白对总硒及蛋白结合硒富集量最高,但蛋白结合硒比率最低,而醇溶蛋白中蛋白结合硒比率最高；富硒发芽糙米蛋白分子量主要分布于13.6-121.4 kDa,硒主要结合于蛋白质中,但不同分子量的蛋白质结合硒的数量与其分子量呈负相关,其中84.3%的硒结合于分子量不高于36.3 kDa的蛋白质中。
4、采用Sephadex G-100凝胶过滤和DEAE-Sephcrose-FF离子交换层析法对富硒发芽糙米硒蛋白进行了分离纯化,所得蛋白质经SDS-PAGE检验为单一条带,其分子量为14.3-15.2 kDa;对已纯化硒蛋白经HPLC测定其氨基酸组成,结果显示各蛋白质样品中谷氨酸含量均为最高,占氨基酸总量的17.97-21.49%,其次为亮氨酸,而半胱氨酸、组氨酸、蛋氨酸含量均在1.5%以下；与蛋白质氨基酸相比,硒代氨基酸含量较低,其中SeCys2和SeMet含量分别为0.091-0.012μg/100μg和0.015-0.017μg/100μg,而Se-MSC含量未检出。经MALDI-TOF-MS肽质量图谱鉴定知,三组蛋白分别为hypothetical protein LOC_Os12g27080、hypothetical protein OsJ_19801和Os01g0348900,其分子量分别为15.11、14.93和15.16 kDa,三种蛋白均来自于水稻粳亚种(Oryza sativa, japonica cultivar-group),与样品属性吻合。
5、研究了富硒发芽糙米硒蛋白总还原力、清除超氧阴离子、DPPH及羟自由基的能力,以及对人胃癌细胞株MGC-823和人肝癌细胞株HePG2的生长抑制和损伤作用。富硒发芽糙米硒蛋白F1、F4和F5在超氧阴离子自由基、DPPH自由基及羟自由基体系中均显示了较强的抗氧化能力,其中F1对羟自由基清除能力显著高于F4和F5,而F5对超氧阴离子自由基、DPPH自由基清除能力最高；各蛋白样品对自由基的清除能力表现出剂量依赖性；三种硒蛋白对人胃癌细胞株MGC-823和人肝癌细胞株HePG2均具有显著的抑制作用,其中F4对两种癌细胞的抑制作用高于F1和F5,其半数抑制浓度最低；随着添加浓度的升高,三种硒蛋白对两种癌细胞的抑制作用呈上升趋势；细胞形态观察显示,三种硒蛋白均能促使人胃癌细胞株MGC-823出现细胞收缩、变圆和浮起,细胞间接触变松,原有贴壁生长被破坏,胞质中颗粒增多,具有细胞凋亡的典型特征。
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