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《南京农业大学》 2011年
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抗微生物活性肽的资源发掘和功能研究

刘蕊  
【摘要】:抗生素的发现和大量使用是有史以来医学上最大的进步,它使人们的健康卫生水平得到了极大的改善,挽救了数以千万计人的生命。然而长期的不合理和大量的抗生素滥用使细菌逐渐产生了耐药性,比如现在临床上产生了很多的“超级细菌”,它们对几乎所有的抗生素都具有抵抗能力,人类一旦感染,极有可能面临死亡。目前细菌耐药性的发展速度远远超过人类新抗生素的开发速度,这一可怕的后果导致能有效使用的抗生素数量越来越少,面临无药可用的境地。 抗菌肽是上个世纪八十年代发现的一种小分子蛋白类物质,由于它对细菌具有超强的杀灭效果、快速的杀灭速度和抗菌谱广等特点,以及独特的不同于抗生素的杀菌机制,使细菌很难对它产生耐药性,因此它极有可能成为在临床上替代抗生素来治疗细菌感染的药物。 在本文中,本着发现更多的抗微生物活性肽资源的目的,我们对三种两栖类(微蹼铃蟾、大蹼铃蟾和黑带蛙)、植物(北美云杉)和人来源的大量活性肽的杀菌活性、溶血活性和结构等作了全面系统的研究。它们其中的一部分拥有强大的杀灭微生物的活性,同时溶血活性较低,展示了良好的临床应用潜力。同时为了进一步探索抗菌肽成为临床抗菌药物的可能性,我们利用基因表达的手段,通过优化表达条件和精简纯化步骤获得了大量有活性的人来源的重组p防御素,为抗微生物活性肽的大规模利用奠定了良好的基础。 据以往报道,人们在两栖类皮肤中发现了大量的抗菌肽,但是关于两栖类脑来源的抗菌肽却很少报道。在本实验中,首先分别从大蹼铃蟾和微蹼铃蟾的脑中分离纯化得到22种和4种抗菌肽,同时通过基因克隆从两者的cDNA文库中得到共79种基因编码的抗菌肽,这些抗菌肽分别属于maximin和]maximin H家族。其中的20个在以前的研究中被报道过,是在大蹼铃蟾的皮肤分泌液中发现的,包括maximin 1-8,10,11和maximinH1,3-5,7,9,10,12,15,16;其余的59个均为首次发现,其中的一些表现出对检测的革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌的较强的杀灭作用。 该研究是目前为止关于动物脑抗菌肽的多样性最为全面的报道,使人们更加关注两栖类的脑抗菌肽—这一抗菌肽的新宝库。 其次,我们以黑带蛙为研究材料,从黑带蛙的皮肤分泌液中分离纯化得到两种与已经发现的brevinin-2家族类似但又结构不同的新抗菌肽。与传统的brevinin-2家族33个氨基酸的一级结构不同,brevinin-2-RN1和brevinin-2-RN2分别由30个氨基酸组成。同时从黑带蛙皮肤的cDNA文库中筛选到5条编码brevinin-2-RN1和brevinin-2-RN2前体的cDNA序列,这些前体由72个氨基酸组成,包括信号肽,酸性肽区域和成熟brevinin-2-RN肽。brevinin-2-RN 1和brevinin-2-RN2表现出了对检测的革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌以及部分耐药临床分离株的很强的杀灭活性,进一步丰富了两栖类抗菌肽资源宝库。 接着我们从北美云杉的基因组一个未知蛋白的前体序列中发现了两个植物抗菌肽,分别命名为piceain 1和2,成熟肽序列分别为KSLRPRCWIKIKFRCKSLKF和RPRCWIKIKFRCKSLKF,各形成一个分子内二硫键。我们通过化学合成研究了它们的抗菌活性,发现它们对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌都有较强的杀灭活性,但是对枯草芽孢杆菌却不敏感。同时它们都具有很强的杀线虫活性,在10μg/mL浓度下孵育5个小时就可以对秀丽隐杆线虫有很高的致死率。piceain1和2对兔和人的红细胞的溶血活性很低,例如在250μg/mL的浓度下,它诱导红细胞的溶血率不到5%。我们利用圆二色谱检测了piceain 1和2在不同溶液中的二级结构,发现piceain 1和2主要的二级结构是p折叠和无规卷曲,α螺旋则比较少。 我们此项工作的意义在于发现了云杉属的一个新的抗菌肽家族,这也是在松科植物中发现的第一个抗菌肽家族。它们有一个分子内二硫键,具有较强的抗菌和杀线虫活性。我们的这一发现不仅丰富了抗菌肽家族,而且对于以后开发抗线虫转基因云杉等在林业中的应用也具有积极的意义。 最后,我们利用原核表达获得了大量有活性的重组人来源p-防御素-2,人p-防御素-2(humanβ-defensin-2, hBD-2)是可以抑制多种病原微生物生长的由41个氨基酸组成的阳离子抗菌肽。由于抗菌肽使微生物不易轻易产生耐受性以及人源性的hBD-2不易在人体内产生免疫原性,因此重组人p-防御素-2将有巨大的潜力成为新型抗菌药物。为研究利用大肠杆菌低成本大量生产活性可溶重组hBD-2的可行性,将化学合成的编码hBD-2成熟肽的基因克隆到pET-32a+表达载体中后再将此重组质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物为带有His-tag标签的hBD-2和硫氧还蛋白的融合蛋白。融合蛋白是以可溶形式进行表达的并随后经His-bind Resin的纯化,纯化后的融合蛋白经甲酸化学裂解后重组hBD-2便得以释放,裂解产物经SephadexG-50和C18 reverse-phase HPLC纯化最后得到了经质谱验证和天然hBD-2分子量一致的高纯度的重组hBD-2。液体生长抑制试验表明表达出的重组hBD-2可以抑制细菌Staphylococcus aureus和Candida albicans的生长,最小抑制浓度(MIC)分别为37.5和150μg/mL。 通过上面四个实验的研究,我们为抗菌肽家族添加了大量的新成员,抗茵活性和溶血活性的研究以及抗菌肽原核表达的研究为将来抗菌肽有可能在临床上的应用打好了基础,希望我们的发现对于人们在未来遭遇耐药菌威胁的时候能够有更多的选择来应对后抗生素时代这一严重的危机。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q51

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