青蛤多糖分离鉴定、硫酸酯化及其生物活性研究

【摘要】：青蛤俗名蛤蜊,属软体动物门,双壳纲,青蛤属,为我国主要的水产贝类,在海洋水产业中具有重要地位。青蛤肉质鲜美,营养丰富,富含蛋白质、氨基酸、脂类、糖类、矿物质元素。传统医学证实,青蛤软体组织水浸提物对发炎、哮喘、口腔溃疡等病症疗效较佳。青蛤水提物的生理活性可能与其富含多糖类物质有关。研究表明,一些源于海洋贝类诸如文蛤、菲律宾蛤仔、翡翠贻贝的多糖具有抗肿瘤、消炎、免疫调节等方面的生理活性,并且关于贝类多糖分离纯化、理化性质、单糖组成、结构等方面研究均有报道。而关于青蛤多糖的研究报道甚少。本实验以青蛤为原料,对青蛤多糖进行提取制备、分离纯化,并对多糖的化学组成、结构特征、化学修饰、生理活性等方面进行分析与研究。研究内容及研究结果具体如下： (一)青蛤多糖提取条件优化 采用单因素实验研究提取工艺参数(提取温度、提取时间、提取次数、水料比)对青蛤多糖产率的影响,结果表明,提取温度、提取时间、提取次数对青蛤多糖产率有显著影响。随着提取温度升高,青蛤多糖产率基本呈上升趋势；提取次数2次以上时,随着提取次数增多,多糖产率变化不明显。在单因素研究的基础上,采用二次正交旋转组合实验设计对提取工艺参数进行优化。通过Design expert 7.0统计软件对实验数据进行处理,得到青蛤多糖提取最佳工艺条件(提取温度90℃,提取时间250 min,水料比29,提取次数2次)。在此工艺条件下青蛤多糖的实际产率为15.52%士1.26%,与模型预测结果(15.62%)基本相符。 (二)青蛤多糖分离纯化、理化性质及结构分析 采用DEAE-纤维素柱层析法对青蛤粗多糖(Crude CSPS)进行初步分离,获得三个组分(F1、F2、F3)。采用Sephdex G-100凝胶柱层析进一步分离纯化,获得三个纯化组分(CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3)。采用HPLC法对CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3的纯度进行鉴定,结果表明,CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3为均一的多糖组分。 采用苯酚-硫酸法、硫酸-间羟联苯法、考马斯亮蓝法、氯化钡-明胶法分别对Crude CSPS、CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3中总糖、糖醛酸、蛋白质、硫酸基含量进行分析。结果表明,Crude CSPS、CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3,总糖含量分别为83.81%、98.75%、95.58%、84.71%；糖醛酸含量分别为1.58%、0.16%、0.96%、2.13%；硫酸基含量分别为0.92%、1.22%、2.08%、3.58%：Crude CSPS、CSPS-3蛋白质分别为3.08%、6.34%,CSPS-1、CSPS-2均未能检出；GC分析表明,Crude CSPS由鼠李糖、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖组成,摩尔百分比分别为：10.88%、12.45%、42.78%、33.89%；CSPS-1由木糖、葡萄糖组成,摩尔百分比分别为：4.92%、95.08%。CSPS-2由葡萄糖组成。CSPS-3由鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成,其摩尔百分比分别为：11.48%、17.15%、12.44%、21.57%、37.36%。HPLC分析结果表明,CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3的平均分子量分别为68.6 kDa、80.6 kDa、100.6 kDa。 采用FT-IR、NMR、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应、GC-MS对CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3结构进行分析。FT-IR分析表明,CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3具有多糖的特征吸收,存在α型构型；NMR进一步证实,CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3均为α型吡喃糖。高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应、GC-MS分析表明,CSPS-1主链由(1→4)-葡萄糖构成,支链为(1→6)-葡萄糖。CSPS-2主链由(1→3)-葡萄糖、(1→4)-葡萄糖构成,支链为(1→2)-葡萄糖、(1→6)-葡萄糖。CSPS-3主链为(1→3)-葡萄糖、(1→3)-半乳糖,支链为(1→6)-葡萄糖。 (三)青蛤多糖硫酸酯化及抗肿瘤活性 采用氯磺酸吡啶法对青蛤多糖纯化组分CSPS-1进行硫酸酯化。通过三因素三水平正交实验研究酯化条件(氯磺酸吡啶比例、酯化温度、酯化时间)对硫酸基取代度(DS)、总糖含量的影响。在正交实验条件制备了DS、总糖含量不同的CSPS-1硫酸酯化样品。CSPS-1硫酸酯化正交实验结果表明,酯化条件对DS的影响由弱到强的顺序为酯化时间酯化温度氯磺酸吡啶比例。酯化条件对总糖含量的影响由弱到强的顺序为酯化时间氯磺酸吡啶比例酯化温度。采用MTT法研究不同酯化条件下制备的硫酸酯化多糖对人胃癌细胞BGC-823的增殖抑制效果,结果表明,不同DS或总糖含量的多糖样品对人胃癌细胞BGC-823的增殖具有不同的抑制效果。硫酸酯化多糖样品的DS、总糖含量越高,其对人胃癌细胞BGC-823的增殖抑制能力越强。氯磺酸吡啶比例为1：4、酯化温度为65℃、酯化时间为2h时,硫酸酯化多糖的DS、总糖含量均达到最大值(0.102、72.19%),并且对人胃癌细胞BGC-823的增殖抑制率最高达89.44%(400μg/ml,72 h)。 (四)青蛤多糖抗癌活性 采用MTT法研究Crude CSPS、CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3对人胃癌细胞BGC-823的增殖抑制效果。结果表明,在50-400μg/ml的多糖浓度范围内,Crude CSPS.CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3对人胃癌细胞BGC-823的增殖抑制率呈现一定的量效关系。随着多糖浓度提高,Crude CSPS、CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3对人胃癌细胞BGC-823的增殖抑制率呈上升趋势。当多糖浓度为400谬g/ml, Crude CSPS、CSPS-1、CSPS-2、CSPS-372 h时对人胃癌细胞BGC-823的增殖抑制率分别为35.16%、58.98%、42.91%、79.89%。在Crude CSPS、CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3中,CSPS-3对人胃癌细胞BGC-823的增殖抑制效果最好,抗肿瘤活性最高。CSPS-3较强的抗肿瘤活性可能与其较高的蛋白质、糖醛酸、硫酸基含量及相对复杂的单糖组成、结构有关。 (五)青蛤多糖抗氧化活性 采用化学方法对Crude CSPS、CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3进行体外抗氧化活性测定。结果表明,Crude CSPS、CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3均具有不同的超氧自由基清除能力、羟自由基清除能力、还原力、脂质过氧化抑制活性、金属离子螯合能力。Crude CSPS、CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3具有一定的体外抗氧化活性。在0.4～4.0 mg/ml的范围内,随着多糖浓度提高,Crude CSPS、CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3的体外抗氧化活性呈上升趋势。青蛤多糖的超氧自由基清除活性由小到大的顺序为CSPS-2 CSPS-1 Crude CSPS CSPS-3,羟自由基清除活性为CSPS-1 CSPS-2 CSPS-3 Crude CSPS,还原力为Crude CSPS CSPS-1 CSPS-2 CSPS-3,脂质过氧化抑制活性为CSPS-2 CSPS-1 CSPS-3 Crude CSP,金属离子螯合能力为CSPS-1 CSPS-2 CSPS-3 Crude CSPS。CSPS-1、CSPS-2、CSPS-3抗氧化活性方面的差异可能是由于多糖的化学组成、分子量、聚合度、硫酸基取代位置、主链特征等方面的差异所致。 青蛤粗多糖体内抗氧化活性采用CCl4诱导肝损伤模型小鼠进行评价。蛋白质含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)等生理生化指标均采用商业试剂盒进行测定。青蛤多糖体内抗氧化实验结果表明,与正常对照组相比,模型对照组处理能够显著提高小鼠血清ALT、AST活性(P0.05),降低肝SOD、GSH-Px活性(P0.05),说明本实验的小鼠CCl4诱导肝损伤模型被成功建立。与模型对照组相比,多糖组能够显著提高小鼠肝SOD、GSH-Px活性(P0.05),降低小鼠肝MDA水平(P0.05),表明青蛤多糖对CC14诱导的肝损伤小鼠具有保护作用。青蛤多糖的护肝效果可能与青蛤多糖提高小鼠自身抗氧化能力以及抑制脂质过氧化有关。