猪有腔卵泡发育与闭锁的内分泌及分子细胞学变化研究

【摘要】：在哺乳动物卵巢中,存在大量的各级卵泡。卵泡生长过程中,仅有少数能够发育至成熟排卵,绝大多数卵泡(99%以上)归于闭锁。闭锁是卵泡发育的正常归宿,对于维持卵巢环境的稳定具有重要意义。卵泡闭锁是许多存活因子和凋亡因子共同参与的复杂调控过程,关于卵泡发育与闭锁调控的研究虽然已有很多报道,但仍存在许多不明之处。研究卵泡发育与闭锁调控的难度受诸多因素的影响,缺乏适当的研究模型也是一个重要原因。近年来,随着细胞凋亡研究的不断深入,人们逐渐认识到卵泡闭锁的实质就是卵泡细胞的凋亡,但颗粒细胞凋亡的调节机理尚不十分清楚。阐明卵泡闭锁机制对于揭示生殖调控的奥秘,提高卵巢利用率和卵母细胞成熟率,提高家畜繁殖效率,均具有重要的理论意义和实用价值。本研究通过分离猪卵巢完整有腔卵泡,采用组织切片技术进行HE染色,观察分析猪有腔卵泡发育和闭锁过程中的形态学特征；通过对分离的有腔卵泡进行培养,建立猪有腔卵泡体外培养模型,研究卵泡组织形态学与颗粒细胞凋亡及类固醇激素变化之间的关系；并采用荧光定量PCR技术测定颗粒细胞Fas/FasL mRNA水平的变化；研究FSH对不同大小有腔卵泡的作用及颗粒细胞凋亡对卵母细胞发育能力的影响,以期为了解猪有腔卵泡发育与闭锁的调控机理提供参考数据。试验共分6个部分： 试验一、猪有腔卵泡发育与闭锁的组织形态学观察本试验通过分离猪卵巢不同发育阶段的完整有腔卵泡进行石蜡组织切片及HE染色,观察分析猪有腔卵泡发育和闭锁过程中的形态学变化。分离的猪完整有腔卵泡因其内卵泡液含量丰富,用常规的组织切片技术难以制作出结构自然、完整的卵泡切片。本实验采用Bouin氏固定液固定猪分离卵泡72 h,二甲苯：乙醇(1：1)过渡法脱水,并适当延长透蜡时间,所获猪分离卵泡组织切片质量和效果优良。观察表明,猪健康有腔卵泡的卵泡腔周围存在少量凋亡细胞；早期闭锁卵泡的基膜与颗粒层有不同程度的分离,颗粒细胞相互间连接松散并开始向卵泡腔脱落,个别小卵泡(31mm)的卵丘-卵母细胞复合体(COC)脱落于卵泡腔,但并未观察到卵母细胞与卵丘细胞的凋亡变化；晚期闭锁卵泡的泡膜层变形、松弛、外围有少量脱落细胞,可见个别肥大的内膜细胞,细胞结构不清晰,与颗粒细胞层之间的界限模糊、基膜消失,大量凋亡的颗粒细胞或凋亡小体充满卵泡腔。卵泡闭锁过程中,大(直径5mm)、中(3-5 mm)、小卵泡的细胞形态特征无肉眼可见的差别。形态学研究表明,本实验眼观检查卵泡并进行早期闭锁、晚期闭锁、健康分类的准确率在76%-92%之间,以健康卵泡的眼观判定最为准确,为卵泡的眼观检查与分类提供了依据。 试验二、猪有腔卵泡的分离及培养模型的建立本试验首次对分离的猪有腔卵泡进行体外培养,以期建立卵泡发育与闭锁研究的体外模型。以TCM199为基础培养液,无血清体外培养从猪卵巢完整分离的大(5 mm)、中(3-5 mm)、小(3 mm)健康卵泡。体外培养8h时,各级卵泡的形态变化与培养前无明显差异；培养16h后卵泡壁血管逐渐模糊,中、小卵泡组的卵泡液发生轻微浑浊,整个卵泡逐渐变得不透明,此时撕开各级卵泡检查时发现,卵母细胞仍包被有5层及以上的致密卵丘细胞；培养24 h后各级卵泡结构虽保持完整,但卵泡表面开始有细胞脱落、卵泡液浑浊,22.2%小卵泡卵母细胞的卵丘细胞包被少于5层,少数卵母细胞出现胞质浓缩现象；培养48 h后,大、中卵泡的卵泡壁塌陷致使整个卵泡的张力消失、发生松弛。此时83.8%的大卵泡和88.3%的中卵泡,卵母细胞仅包被1-2层卵丘细胞,且排列疏松；小卵泡的卵泡壁开始溶解,颗粒细胞散在分布于卵泡液中,卵泡外观发白,卵母细胞均成为裸卵并发生退化。本实验结果显示,所用无血清培养体系可有效诱导猪完整有腔卵泡的进一步闭锁,是用于研究促性腺激素、生长因子、细胞因子等对卵巢卵泡发育的影响及类固醇激素作用的一个适当模型。 试验三、猪卵泡发育与闭锁过程中颗粒细胞凋亡与激素变化分析从猪卵巢分离完整的有腔卵泡,先按其质量分为3组：健康卵泡、早期闭锁卵泡和晚期闭锁卵泡组；按直径大小再分为3组：大卵泡组卵泡直径5 mm、中卵泡组卵泡直径3-5 mm和小卵泡组直径3 mm。取健康卵泡进行体外培养,分别于0(培养前对照组)、8、16和24 h,以Annexin-V FITC/PI双染流式细胞仪检测壁层颗粒细胞凋亡情况,放射免疫测定法(RIA)分析卵泡液中雌二醇(E2)和孕酮(P4)浓度的变化。结果发现,不同大小的健康体内卵泡也存在少量的凋亡颗粒细胞,卵泡闭锁时则颗粒细胞凋亡率显著增加,这在小卵泡表现得尤为明显；晚期闭锁小卵泡中约有60%的颗粒细胞发生凋亡。健康大卵泡组卵泡液中E2浓度显著高于中、小卵泡组；P4浓度与中卵泡组无差异,但显著高于小卵泡组。卵泡在不同健康状态下,不同大小卵泡的卵泡液中P4/E2比值存在差异。中、小健康卵泡的卵泡液中P4/E2比值均5,而健康大卵泡的卵泡液中P4/E2比值1。卵泡发生闭锁时,不同大小卵泡均表现出E2浓度显著下降和P4浓度显著增加,早期闭锁大卵泡卵泡液中P4/E2比值1,而早期闭锁中、小卵泡中P4/E2比值在5-15之间；当P4/E2比值15时,卵泡则处于晚期闭锁状态。体外培养卵泡8 h,颗粒细胞的总凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)就已达70%以上,至24 h时达81.1%-94.6%。不同大小卵泡组随培养时间增加,E2和P4浓度呈逐渐下降的趋势,小卵泡组卵泡液中E2和P4浓度在培养的各时间点均低于大、中卵泡组,但差异不显著。本试验结果表明,无血清卵泡培养体系可明显诱导培养卵泡的颗粒细胞凋亡,颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的主要诱因,但卵泡闭锁程度可因卵泡大小而异,小卵泡似乎更易发生闭锁；卵泡液中P4/E2浓度比值可作为有腔卵泡质量判定的一个标准。 试验四、猪有腔卵泡颗粒细胞Fas/FasL mRNA的表达本试验旨在研究不同发育阶段的猪有腔卵泡Fas/FasL mRNA表达与颗粒细胞凋亡的关系,探讨卵泡闭锁的规律及分子调控机理。从猪卵巢分离完整有腔卵泡,先按质量分为健康卵泡、早期闭锁和晚期闭锁卵泡3组；再按卵泡直径大小分为大、中和小3组。取健康卵泡进行体外无血清培养,收集培养0、8、16、24、48和72 h的卵泡壁层颗粒细胞,用Real time PCR SYBRgreen法检测各组卵泡颗粒细胞Fas及FasL mRNA的相对表达量。猪不同发育阶段有腔卵泡的颗粒细胞中均有Fas/FasL mRNA表达。卵泡闭锁时,FasL mRNA表达量显著增加,而Fas mRNA表达量与健康卵泡组相比无显著差异。早期闭锁卵泡组,小卵泡颗粒细胞中FasL mRNA表达量显著高于大、中卵泡组。体外培养发现,不同大小卵泡的颗粒细胞中FasL mRNA水平随培养时间显著增加,培养至24 h达最大值(P0.05)；小卵泡颗粒细胞FasL mRNA水平均高于大、中卵泡组。不同大小卵泡颗粒细胞Fas mRNA相对表达量在培养前(O h)差异不显著,培养8h时显著增加,48 h达最大值。本实验表明,Fas/FasL系统在猪各级有腔卵泡闭锁过程中,对颗粒细胞凋亡具有重要的调节作用。体内外调节Fas mRNA表达的因素存在差异性；体内FasL的高表达可能是启动Fas/FasL凋亡通路的主要诱因。 试验五、FSH对分离的猪有腔卵泡体外培养的作用采用所建立的猪有腔卵泡体外无血清培养体系,研究探讨FSH对猪有腔卵泡体外培养的影响。从猪卵巢分离大、中、小健康的完整卵泡,以TCM199为基础培养液分别添加1、3、5IU/mL FSH进行无血清体外培养,于培养的0、8、16、24、48和72 h,用Annexin-V FITC/PI双染流式细胞仪检测各组颗粒细胞凋亡率,Real time PCR法测定FSH对壁层颗粒细胞中Fas与FasL mRNA相对表达量的影响,RIA法测定卵泡液中E2和P4浓度的变化。结果发现,添加1IU/mL FSH对颗粒细胞凋亡的抑制作用并不显著,Fas与FasL mRNA表达量在培养的各个时间均与对照组无异。添加3-5 IU/mL FSH可显著抑制各级卵泡的颗粒细胞凋亡,并表现出剂量依赖性；对大卵泡颗粒细胞的作用尤为明显。5 IU/mL FSH可降低各级卵泡颗粒细胞Fas和FasL mRNA表达量,以24 h培养组作用最为显著；3 IU/mL FSH对Fas mRNA表达量无显著抑制作用。FSH可促进大、中和小卵泡E2和P4的分泌,但均未达显著水平。 试验六、猪卵泡发育过程中细胞凋亡对卵母细胞发育能力的影响本试验旨在研究卵泡细胞凋亡对卵母细胞发育能力的影响,以期了解卵泡完整性在支持和促进猪卵母细胞生长发育过程中所发挥的作用。测量猪不同发育阶段有腔卵泡卵母细胞的直径变化；并将3-5 mm直径的健康卵泡及同等大小卵泡来源的COC分成2组进行体外无血清培养,培养8h后分别取卵泡组壁层颗粒细胞、卵丘细胞及COC组卵丘细胞,用Annexin V-FITC/PI法进行凋亡分析；结合FDA染色进行卵母细胞存活鉴定,体外受精后进行卵裂率对照。结果表明,随着有腔卵泡的生长,其卵母细胞的直径有显著增加；当卵泡直径达5 mm以上时,卵母细胞直径可达成熟时的大小。中、小卵泡一旦发生闭锁,卵泡发育就告终止；中卵泡组发生早期闭锁时,其卵母细胞直径与健康组相比无差异,此时偶见少量卵母细胞(5%)发生死亡；晚期闭锁时,中卵泡组卵母细胞直径和存活率均显著下降,但其存活率仍显著高于小卵泡组。小卵泡卵母细胞直径和存活率在卵泡早期闭锁时即显著下降；而早期闭锁大卵泡组卵母细胞的直径和存活率与健康组无异。与大、中卵泡相比,卵泡闭锁对小卵泡COC形态变化的影响更为明显,但晚期闭锁小卵泡卵母细胞依然有80%以上包被3层及以上的卵丘细胞。培养卵泡组的卵丘细胞凋亡率要显著低于培养COC组,但两组的卵母细胞存活率无显著差异；培养卵泡组所获卵裂率显著高于培养COC组(24.55%对0%，P0.05),但均明显低于常规COC成熟培养对照组。本研究表明,完整卵泡对卵丘细胞凋亡及卵母细胞发育能力似乎有明显的保护作用；完整的卵泡结构及其内卵泡细胞与卵母细胞间的相互作用,有助于延迟卵泡闭锁时卵母细胞所受到的抑制。

【关键词】：猪 有腔卵泡 闭锁 凋亡 促卵泡素 FasL/Fas mRNA
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S828
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