收藏本站
《南京农业大学》 2010年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶酶学特性及其酶基因克隆、表达的研究

姚大伟  
【摘要】:随着畜牧业的可持续发展,我国蛋白质饲料持续短缺,新型蛋白质饲料资源的开发变得越来越紧迫。新型蛋白质饲料的开发技术主要是利用现代生物技术将一些利用率低的饲料资源或非常规饲料资源变为新型蛋白饲料,提高其利用率。现代生物技术在开发利用新型蛋白质饲料方面主要应用发酵工程技术生产发酵饲料、酶工程技术生产酶解饲料等。无论是发酵工程技术还是酶工程技术都涉及微生物资源或微生物酶资源的开发与利用。利用发酵技术或酶技术在以羽毛粉为对象开发新型蛋白质饲料的过程中筛选各种细菌、真菌和放线菌。其中细菌以芽孢杆菌属细菌居多,该菌属细菌多数产碱性蛋白酶,已有大量的碱性蛋白酶被开发应用于各种工业生产。目前,在羽毛角蛋白降解方面还仅处于酶的分离与纯化的研究,如何采用基因工程技术提高酶的产量是当今的研究热点。本试验在本实验室前期微生物菌种资源筛选的基础上对比研究血红蛋白降解菌短小芽孢杆菌NJM4和角蛋白降解菌短小芽孢杆菌WHK产蛋白酶性质,从中选取产蛋白酶活力较高的WHK4菌株作为研究素材,对其蛋白酶进行分离纯化,并对蛋白酶的酶学性质进行了研究,深入了解该酶的特性,为今后的开发利用奠定理论基础。同时对于如何提高NJM4的产酶能力本试验采用基因重组的方式研究碱性蛋白酶基因在大肠杆菌和短小芽孢杆菌中的表达。试验分为以下6个部分: 试验一、短小芽孢杆菌NJM4与WHK4生物学特性的比较研究 系统地比较研究了短小芽孢杆菌—-NJM4与WHK4生物学的差异,分析两者产蛋白酶差异的原因。首先比较两者的培养、生理生化特性,然后比较分析了两者在相同培养基内对产蛋白酶活力及其对不同底物活力的影响。在基因水平上比较了两者碱性蛋白酶基因以及该基因上游启动子区域的基因序列。结果显示:两者生理生化特性无差异,在培养特性方面则有差异,WHK4的生长速度较快,在相同的培养基中24 h内产生芽孢,而NJM4在相同的时间内未形成芽孢;在产酶方面,WHK4在血红蛋白和羽毛粉发酵培养基内产蛋白酶活力高于NJM4,在营养丰富的LB培养基中产蛋白酶活力却低于NJM4。分别以不同底物测定的蛋白酶活力WHK4均高于NJM4。在基因水平上两者碱性蛋白酶基因1152bp的碱基中虽然只有一个碱基不同,但其对应的密码子所编码的氨基酸属同一个氨基酸,启动子区域49bp的基因序列完全相同。试验表明WHK4较NJM4产酶能力强,酶活力高,是产蛋白酶的优良菌株。 试验二、短小芽孢杆菌WHK4以羽毛粉为底物产蛋白酶条件的优化 探索WHK4以羽毛粉为底物产酶的最佳条件和最佳培养基组成。以羽毛粉发酵培养基为基础,首先采用单因子试验研究底物浓度、初始pH、接种量、外加碳源、外加氮源对WHK4产酶活力的影响。在单因子试验的基础上采用正交试验设计对底物浓度、温度、初始pH、接种量、外加(NH4)2SO4、外加麦芽糖进行优化。结果显示:WHK4最佳的产酶条件为初始pH 7.38,菌龄16 h,接种量5%,37℃。最佳的培养基组成为:1 L基础发酵培养基,40.0 g羽毛粉,10.0g(NH4)2SO4和10.0 g麦芽糖。在优化的条件下WHK424 h产蛋白酶活力为90U·mL-1。WHK4培养条件及培养基的优化为其产蛋白酶的分离纯化奠定了基础。 试验三、短小芽孢杆菌WHK4蛋白酶的分离、纯化及酶学特性的研究 为得到WHK4酶的纯品,更好的了解该酶的酶学特性,本试验在优化的产酶条件下首先制备粗酶液,然后采用50%饱和硫酸铵盐析,沉淀用1/10体积的PBS溶液溶解后透析除盐,经Sephdex G-100凝胶过滤层析分离出蛋白酶。对所得的蛋白酶进行SDS-PAGE酶谱分析,测定酶最适作用温度和pH,对酶学特性进行测定。结果显示:WHK4以羽毛粉为底物发酵液中含有两种蛋白酶,其中一种蛋白酶分子量约为50 KD,该酶作用最适温度为60℃,最适pH为8.5, Fe3+、Cu2+、SDS、EDTA对蛋白酶活力有较强的抑制作用,Ba2+、Ca2+、Mg2+和Fe2+以及有机溶剂DMSO、异丙醇、甘油,表面活性剂TritonX-100对蛋白酶活力几乎无影响。表明该酶属于金属蛋白酶,在耐有机溶剂生物催化剂方面有潜在的应用前景,在洗涤工业生产中也有较大的应用价值。 试验四、短小芽孢杆菌NJM4碱性蛋白酶基因的表达与活性分析 为提高碱性蛋白酶的产酶量,本试验研究其在大肠杆菌中的表达。采用同源克隆的方法设计碱性蛋白酶基因扩增引物,用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增,然后将扩增的PCR产物和克隆载体pUC57经XbaⅠ和BamHⅠ(?)双酶切后连接构建pUC57-AP,转化TOP10感受态细胞,涂布LB/Amp/X-gal/IPTG培养基平板,挑选白色菌落进行PCR鉴定,然后测序分析。将PCR产物和表达载体pET-28b经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后连接构建pET-28b-AP,转化BL21(DE3)感受态细胞,涂布LB/Kan/酪蛋白培养基平板,挑选有水解圈的阳性克隆进行PCR鉴定,对阳性克隆用IPTG诱导4h后测定发酵液的蛋白酶活力。结果表明,克隆得到的NJM4碱性蛋白酶基因全长为1152 bp,编码383个氨基酸,成熟肽276个氨基酸。从LB/Kan/酪蛋白平板培养基筛选有透明水解圈的菌株,命名为BL21(DE3)-28b-AP。该菌株经IPTG诱导后发酵上清液蛋白酶活力为不含重组子菌株的37.3倍。成功地构建具有蛋白酶活力的高效表达的菌株为碱性蛋白酶的批量生产奠定了基础。 试验五、短小芽孢杆菌NJM4原生质体转化研究 探索短小芽孢杆菌原生质体的形成条件及其转化的可行性。采用溶菌酶脱壁制备原生质体,进行单因子试验,显微镜观察酶的浓度、作用温度,酶解时间对原生质体形成率的影响。在最适宜的条件下制备原生质体,在Ca2+的环境中用PEG6000诱导pUC57-AP重组质粒的转化,采用含氨苄青霉素的DM3培养基平板筛选转化子。结果显示,用含氨苄青霉素的DM3培养基平板筛选的转化子经含氨苄青霉素的液体培养基培养后其蛋白酶的活力几乎丧失。表明短小芽孢杆菌NJM4易于原生质体化,可以实现外源质粒转化,是一株潜在的基因工程受体菌。 试验六、分光光度计法检测原生质体形成过程的初步研究 探索芽孢杆菌原生质体形成过程中光密度的变化与原生质体形成率之间的关系。采用分光光度计测定原生质体形成过程中溶液的OD600nm,同时采用镜检计数测定原生质体形成率,分别绘制光密度变化曲线和原生质形成曲线,采用SPSS统计软件中Curve Estimation分析两者之间的相关性并进行曲线拟合。结果显示:原生质体溶液光密度的变化和原生质体的形成率之间存在显著的相关性(R2=0.985,P0.01),随着原生质体形成率的增加溶液光密度逐渐减小,两者之间呈负相关,3次多项式曲线拟合最佳(Y=0.746-0.01t+1.83×10-4t2-1.171×10-6t3)。表明原生质体形成过程中通过动态监测原生质体溶液光密度的变化可实现原生质体形成率的定量分析。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S816.7

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 马梅琴;赵静;汪庆生;;牦牛蹄碱性蛋白酶脱毛关键技术研究[J];黑龙江畜牧兽医;2011年16期
2 朱新鹏;;碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白质工艺的研究[J];保鲜与加工;2011年04期
3 张庆花;王学东;;碱性蛋白酶对麦胚蛋白水解作用的研究[J];粮食科技与经济;2011年04期
4 付红梅;李淼;檀根甲;王子迎;赵平生;;大豆疫霉拮抗菌株的筛选与鉴定[J];安徽农业科学;2011年19期
5 逄昔莎;徐汉虹;廖美德;黄海翔;;抗真菌活性菌株BP08的鉴定及培养条件和培养基的优化[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2011年08期
6 陈耿华;王磊;王强;毛学英;;用于连续制备乳清蛋白ACE抑制肽的酶膜反应器运行条件优化[J];农产品加工(学刊);2011年09期
7 孙睿揆;王志远;飞兴文;吴毅歆;吴兴兴;毛自朝;何月秋;;辣椒白粉病生防菌株Bs2的筛选鉴定及田间防效研究[J];西南农业学报;2011年03期
8 蓝建京;刘旭辉;伍善广;廖丹葵;;酶法制取丝素降胆固醇肽的工艺研究[J];安徽农业科学;2011年21期
9 梁晓梅;黎明;成堃;贾红红;路福平;;大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的构建及碱性蛋白酶的表达[J];生物技术通报;2011年06期
10 张玲;王晓闻;;欧李仁蛋白多肽的制备[J];农产品加工(学刊);2011年10期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 潘皎;黄庆;张义正;;短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)碱性蛋白酶基因的克隆和表达[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
2 黄庆;彭勇;张义正;;制革脱毛酶的纯化及其基因的克隆与序列分析[A];首届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2002年
3 杨金龙;潘康成;;高产碱性蛋白酶地衣芽孢杆菌的研究进展[A];中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第七次学术研讨会论文集[C];2004年
4 马向东;柯涛;熊兰;张桂敏;康立新;明华安;马立新;;一株产环糊精葡萄糖基转移酶的短小芽孢杆菌的选育,产酶条件及酶学特性研究[A];2006年度学术研讨会论文摘要汇编[C];2006年
5 江正兵;马立新;;短小芽孢杆菌的木聚糖酶基因的表达[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年
6 赵明莲;张克勤;;食线虫真菌碱性蛋白酶cDNA基因的克隆及在Pichia pastoris中的异源表达[A];中国菌物学会第三届会员代表大会暨全国第六届菌物学学术讨论会论文集[C];2003年
7 管刚;赵静;张俊;白伟;;应用碱性蛋白酶制取牦牛血红素工艺的研究[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集(下册)[C];2009年
8 孙冰玉;石彦国;;碱性蛋白酶对醇法大豆浓缩蛋白乳化性的影响研究[A];中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2007年
9 郝建华;孙谧;王跃军;;海洋微生物低温碱性蛋白酶QDApr的生物信息学分析及同源模建[A];中国海洋学会2005年学术年会论文汇编[C];2005年
10 郝建华;袁翠;王跃军;孙谧;;低温碱性蛋白酶QDAPr的生物信息学分析及同源模建[A];生物技术对水产业的促进作用——2005水产科技论坛论文集[C];2005年
中国重要报纸全文数据库 前9条
1 ;酶制剂让谁受益[N];中国化工报;2000年
2 ;使用洗衣粉注意事项[N];西藏日报;2003年
3 实习生 孟磊;海洋酶研究引发可观产业效益[N];科技日报;2001年
4 ;洗涤剂用复合酶[N];中国乡镇企业报;2002年
5 曹涤环;合成洗衣粉危害人体健康[N];湖北科技报;2000年
6 魏公铭;酶法生产低聚木糖开发成功[N];粮油市场报;2001年
7 中国环境科学研究院环境污染与健康创新基地 聂静 张金良 中国洗涤用品工业协会;洗衣多用巧办法[N];健康报;2009年
8 ;抗球虫剂——腐霉素和拉沙洛西[N];中国畜牧兽医报;2009年
9 解放军总医院第一附属医院皮肤科 邹先彪;用加酶洗衣粉要戴手套[N];健康时报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 姚大伟;短小芽孢杆菌碱性蛋白酶酶学特性及其酶基因克隆、表达的研究[D];南京农业大学;2010年
2 黄庆;脱毛蛋白酶的纯化及其基因的克隆与表达研究[D];四川大学;2003年
3 潘皎;短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的碱性蛋白酶基因的表达研究[D];四川大学;2004年
4 王海燕;脱毛蛋白酶产生菌的选育及其碱性蛋白酶基因的克隆与表达[D];四川大学;2006年
5 陈云鹏;短小芽孢杆菌表达系统的优化研究[D];复旦大学;2004年
6 许正宏;微生物耐碱性木聚糖酶的合成、调控及底物降解方式的研究[D];江南大学;2005年
7 张丽珍;多菌灵降解菌的降解特性及GFP标记[D];山西大学;2007年
8 马春玲;海洋酵母普鲁兰类酵母碱性蛋白酶发酵生产、特性研究及基因克隆[D];中国海洋大学;2007年
9 孙晓波;短小芽孢杆菌组成型高效表达分泌系统的建立与应用[D];复旦大学;2006年
10 郭继平;米曲霉碱性蛋白酶的异源表达和定向进化以及遗传改造[D];哈尔滨工业大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 褚忠志;产碱性蛋白酶菌株Bacillus pumilus Zk202的选育与酶学性质研究[D];甘肃农业大学;2008年
2 王伟伟;枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶抗烟草花叶病毒活性及其酶学性质的初步研究[D];西北农林科技大学;2008年
3 张亚娟;从猪血中酶法制取血红素的研究[D];江南大学;2007年
4 黄志强;产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及其基因克隆[D];福建农林大学;2006年
5 王健华;碱性蛋白酶高产菌株的选育与酶学性质研究[D];河北大学;2005年
6 张映京;南极中山站沉积物宏基因组文库的构建及碱性蛋白酶基因ACPRO001的克隆、表达和性质分析[D];厦门大学;2009年
7 姜健美;黄酒糟蛋白酶法提取工艺研究[D];浙江大学;2007年
8 奚海燕;大米蛋白的提取及改性研究[D];江南大学;2008年
9 蒋承建;碱性土壤宏基因组文库的构建以及碱性蛋白酶AP01基因的克隆[D];广西大学;2005年
10 孟鹏;大豆多肽制备及其酶法脱苦的研究[D];南京林业大学;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026