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鹰嘴豆耐旱种质的筛选、cDNA文库构建、EST数据分析及耐旱相关基因克隆

高文瑞  
【摘要】:随着全球性的气候异常和生态平衡的破坏,干旱、沙化、盐碱土地面积急剧增加,水资源短缺已成为全人类面临的一个严重生态问题。干旱也已成为一种世界性的重大农业灾害,其对农作物造成的损失在所有的非生物胁迫中居首位,仅次于生物胁迫病虫害造成的损失。 鹰嘴豆是最早被人类驯化利用的豆科植物之一。在豆科类作物中居第3位,是世界上栽培面积较大的食用豆类作物之一。鹰嘴豆具有耐旱、抗逆、水分利用效率高等特点,是进行作物耐旱性改良的重要基因资源。本研究首先从我国新疆的鹰嘴豆品种中筛选鉴定耐旱品种,然后在构建鹰嘴豆幼苗水分胁迫下两个平行cDNA文库及其EST序列分析的基础上,克隆与水分胁迫响应的重要基因,并研究其表达模式,结果如下: 1、鹰嘴豆干旱胁迫条件下生理生化的研究与耐旱性筛选鉴定 通过室内试验,以耐旱性强弱不同的12个鹰嘴豆品种为材料,对干旱胁迫下鹰嘴豆叶片的相对含水量、丙二醛含量、脯氨酸含量等生理生化指标进行研究,探讨了这些生理生化指标与耐旱性的关系,同时通过系统聚类的方法对12个鹰嘴豆品种进行了耐旱性综合评价。结果表明,耐旱性较强的品种叶片保水能力强,水分亏缺小,脯氨酸增加倍数大,能保持较高的细胞膜相对完整性,细胞膜脂过氧化作用较小,净光合速率下降幅度较小,蒸腾速率和气孔导度下降幅度较大,水分利用效率较高。12个品种可划分为高耐旱性、中耐旱性和低耐旱性3个类群。对耐旱性强的209和耐旱性弱的88-1进行干旱胁迫下叶片和根中内源激素变化的研究表明,60 mM PEG 4000胁迫24 h后两个品种的ABA与IAA含量均显著增加,但209的增幅大于88-1;GA和ZR含量均显著降低,且209的降幅大于88-1。 2、鹰嘴豆叶片cDNA文库的构建 在前期鉴定鹰嘴豆耐旱性基础上,选取耐旱性较好的品种209用于构建PEG 4000模拟的干旱胁迫(MH1)和正常生长(MH2)的两个平行的cDNA文库。通过梯度稀释与细菌平板记数法计算出MH1库容量为4.9×105,重组率为92%;MH2库容量7.5×105,重组率为90%。经过菌落PCR鉴定,两个文库中外源基因的插入片段基本上均达到1 Kb以上。因此构建的cDNA文库均符合文库标准,可以进行下一步大规模的EST测序。这为筛选抗旱相关的重要基因提供了有效的平台,为基因克隆等奠定了良好的基础。 3、两个鹰嘴豆叶片cDNA文库大规模测序及EST序列分析 对前期构建的两个非均一化的cDNA文库(一个是PEG 4000胁迫处理文库,另一个是对照文库)进行了EST测序。每个文库随机挑选2500个左右的克隆进行测序,并对测序结果进行生物信息学分析。经过IDEG6在线生物软件分析,结果表明有92个基因的表达差异显著,且这些基因参与了不同的生物学过程。许多上调表达的基因都与干旱耐性相关,而下调表达的基因大多数与光合作用相关。为验证文库分析的结果,挑选了5个差异表达的基因进行实时荧光定量PCR(qPCR)分析,结果表明,qPCR结论与EST分析的结果一致。本结果将为鹰嘴豆耐旱分子基础的研究做出重要的贡献。 4、鹰嘴豆S—腺苷甲硫氨酸(SAM)代谢途径中几个重要基因的克隆及其表达研究 在对前期构建的两个鹰嘴豆叶片cDNA文库5’随机测序和序列拼接注释的基础上,克隆了鹰嘴豆SAM代谢途径中的CpSAMs、CpMS及CpSAMDC3个重要基因,并对这三个基因进行了相关的生物信息学分析。结果表明这3个基因都包含了完整的开放阅读框,其中CpSAMs基因编码的蛋白包含了两个腺苷甲硫氨酸信号结构域,CpMS基因编码的蛋白含有Meth_synt_1和Meth_synt_2两个结构域,CpSAMDC基因编码的蛋白包含了酶原剪切位点和PEST两个结构域。同时为了研究SAM代谢途径与鹰嘴豆耐旱的相关性,对该途径中CpSAMs、CpMS、CpSAHH和CpSAMDC等4个基因进行了半定量RT-PCR分析。结果表明这4个基因于干旱胁迫的初始阶段在根和叶中的表达量都上升,在根、茎、叶中的表达存在组织特异性。因此,SAM代谢途径可能参与鹰嘴豆干旱胁迫响应。


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