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利用EST预测苹果的microRNA并用miR-RACE验证其精确序列

于华平  
【摘要】:植物miRNA是广泛分布于植物基因组中的长度在19-24个核苷酸的内源性非编码RNA,是真核生物基因表达的一类负调控因子,主要通过指导靶基因的切割或降低靶基因的翻译从转录后水平上抑制植物基因表达,在控制植物的发育、开花时序、新陈代谢、应激反应等方面起着重要作用。miRNA的保守性特点为基因组信息不完全的非模式植物提供了良好的基础。目前,有关miRNA的报道很多,果树上也有相关的报道,但在苹果上还未有关于miRNA精确序列确定及其niRNA和靶基因表达特性的报道。 苹果是世界性的重要的经济水果之一。除了它的经济价值,大量有效的ESTs信息,使之成为基因表达研究的极好的实验材料。 本论文以苹果为实验材料,通过生物信息学预测了苹果中的miRNA及其靶基因,并用qRT-PCR研究了苹果中miRNA及其靶基因的表达。使用了miR-RACE方法鉴定生物信息学预测的:miRNA的精确序列。主要研究结果如下: 1.用生物信息学预测miRNA的方法。从NCBI数据库中苹果的32,4000个EST中挖掘miRNAs。通过采取一系列的筛选条件,我们从苹果的EST序列中找到了31个潜在的miRNA,这些潜在的miRNA属于16个基因家族分别是:mdo-miR156, mdo-miR162, mdo-miR167, mdo-miR172, mdo-miR393, mdo-miR394, mdo-miR398, mdo-miR477, mdo-miR482, mdo-miR828, mdo-miR845, mdo-miR1535, mdo-miR1888, mdo-miR1046, mdo-miR2101. 2.本研究中,我们报告一个有效的方法来确定生物信息学预测的miRNA精确序列。这个方法主要包括小RNA文库的构建,miRNA的5'RACE和3'RACE, RACE产物的克隆测序。我们的方法的核心步骤,是两个PCR反应扩增miRNA的5'RACE和3'RACE以及特异引物的设计。通过这种方法我们确定了16个mdo-miRNA的精确序列。我们验证和预测的序列也不是100%相同的,与预测的相比主要是mdo-miR1535的最后两个碱基有差异。 3.通过使用潜在的miRNA序列,进一步使用NCBI中mRNA数据库的BLAST搜索,预测到12个mdo-miRNA的靶基因,并对这些靶基因进行了功能分析,发现这些靶基因在苹果的生长和发育过程中起着重要的作用。 4.为了进一步研究苹果在整个生长发育时期miRNA及其靶基因的表达特性,我们从苹果的不同发育时期的茎、叶(幼叶和老叶)、花(花芽和花蕾)、果(直径分别为1.5cm和4cm的小果和大果)等不同器官构建了小RNA的cDNA文库,利用荧光定量PCR研究精确序列的表达。同时也构建了总RNA的cDNA文库,研究了预测的靶基因的表达。结果表明:一些苹果的miRNAs是在所有检测的组织器官中都是表达的,一些miRNA表现出器官、物种或不同生长发育时期的特异性表达。Mdo-miRNAs和其靶基因在苹果不同发育时期的不同器官中存在着相互消长的关系。


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