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《南京农业大学》 2010年
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Hsp70介导IUGR仔猪早期免疫功能损伤的机理及谷氨酰胺的营养调控研究

钟翔  
【摘要】:子宫内发育迟缓(IUGR)在人类医学上是一个难题,由于在猪生产上具有高发率(15-20%),同样给畜牧生产带来严重损失。本试验研究IUGR对新生仔猪免疫功能以及hsp70mRNA和蛋白表达的影响;采用RNA干扰技术,研究Hsp70介导IUGR仔猪早期免疫功能损伤的机理,并从营养学的角度,研究谷氨酰胺对断奶IUGR仔猪免疫功能和Hsp70表达的影响,探讨IUGR对新生仔猪出生后生长发育的影响,并分别从分子生物学角度和从营养学角度探讨Hsp70介导NF-κB免疫信号通路损伤的机制和谷氨酰胺对IUGR新生仔猪出生后生长发育的影响,为养猪生产和人类医学研究提供理论依据和调控技术手段。 1、IUGR对新生仔猪免疫功能和肠道黏膜Hsp70和FoxO3a表达的影响 选择15头正常体重仔猪(NBW)和15头IUGR仔猪,分别在出生(0日龄)和7日龄时屠宰取样(n=5),分别测定出生体重、肠道重量、肠道绒毛高度、隐窝深度、血清及肠道黏膜中的细胞因子水平,以及肠道黏膜中Hsp70和FoxO3a的表达。试验结果表明: (1)在0日龄和7日龄时,IUGR仔猪体重和各段肠道的绝对重量极显著低于NBW仔猪(P0.01)。IUGR仔猪空肠前段和回肠的相对重量显著低于NBW仔猪(P0.05)。此外,IUGR可导致仔猪各段肠道绒毛萎缩(P0.05或P0.01),绒毛高度与隐窝深度比值降低(P0.05)。在7日龄时,与NBW仔猪相比,IUGR仔猪外周血T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖显著降低(P0.05),血清IgG含量低于NBW仔猪20.8%(P0.05),血清IgM含量同样有降低的趋势,但差异不显著。IUGR仔猪血清和回肠中IFN-γ和IL-10含量低于NBW仔猪(P0.05),但对IL-8没有影响。此外,与NBW仔猪比较,IUGR仔猪血清中IL-4含量极显著降低35.0%(P0.01),但肠道中IL-4的水平反而提高了31.0%(P0.05)。 (2)在0日龄时,IUGR仔猪空肠前段和空肠后段hsp70mRNA的表达显著高于NBW仔猪(P0.05),在7日龄时,IUGR仔猪空肠后段和结肠hsp70mRNA的表达比NBW仔猪分别提高了13.2%(P0.05)和20.3%(P0.05)。同样,与NBW仔猪比较,IUGR仔猪空肠前段、回肠和结肠Hsp70蛋白表达显著提高(P0.05)。免疫组化的结果表明,Hsp70蛋白主要位于细胞外和肠上皮细胞细胞质中,且大量在绒毛和肠腺表达,而在黏膜固有层和肠肌层没有Hsp70的阳性信号。此外,在7日龄时,IUGR仔猪空肠和回肠FoxO3a的表达比NBW仔猪分别提高了15.5%(P0.05)和14.9%(P0.05)。 2、Hsp70介导NF-κB免疫信号通路损伤的机理研究 采用体外培养IEC-6细胞的方法,将试验分成对照组、LPS组、LPS+heat组:LPS+siRNA组和LPS+siRNA+heat组。首先对LPS的作用浓度、不同热应激温度和转染时间进行筛选,确定作为Hsp70基因干涉的最佳条件,然后采用Western blot和流式细胞仪方法研究Hsp70对NF-κB信号通路、FoxO3a表达以及细胞凋亡的影响。试验结果表明:1000ng/mL LPS、41℃1h、转染48h可作为Hsp70基因干涉的最佳条件。LPS可诱导IEC-6细胞中NF-κB的核移位(P0.05),热应激可在一定程度上抑制NF-κB的核移位。将Hsp70基因干涉之后,NF-κB的核移位高于其它三组(P0.05)。相反,与对照组比较,LPS诱导IEC-6细胞中I-κBα降解,差异极显著。热应激后,与LPS组相比,LPS+heat组I-κBa降解极显著降低(P0.01)。Hsp70基因干涉组IEC-6细胞中I-κBα的降解极显著增加。LPS诱导IEC-6细胞后,LPS组IKKa/p活性极显著升高。LPS诱导加上热应激后,IKKa/p的活性显著受到抑制。将Hsp70表达抑制后,与对照组比较,IKKa/β的表达显著升高。此外,LPS组细胞中FoxO3a的表达极显著高于对照组,将Hsp70基因干涉之后,IEC-6细胞中FoxO3a的表达极显著降低。流式细胞仪检测结果表明,LPS可诱导41.8%的细胞凋亡(P0.01)。与LPS组相比,热应激后IEC-6细胞凋亡极显著降低,但与对照组,IEC-6细胞凋亡仍极显著升高。将Hsp70基因沉默后,IEC-6细胞凋亡极显著低于其它三组(P0.01)。 3、谷氨酰胺对断奶IUGR仔猪免疫功能和Hsp70表达的影响 选择21日龄,体重相近(3.5±0.5kg)的20头IUGR仔猪,随机分成对照组和谷氨酰胺组(Gln组),并灌喂1g/kg体重的谷氨酰胺或等氮的丙氨酸。断奶后14d,屠宰取样,分别采用ELISA、RT-PCR和Vestern blot方法检测仔猪细胞因子、hsp70mRNA和蛋白的表达。结果表明,Gln组断奶仔猪的平均日增重提高了27.1%(P0.05),料重比降低了15.2%(P0.05)。与对照组相比,Gln能显著提高空肠绒毛高度和绒毛高度与隐窝深度比值(P0.05)。此外,Gln能显著降低血液和肠道中炎性细胞因子IL-1和IL-8的水平,提高IL-4的含量。G1n组十二指肠和空肠中hsp70mRNA的表达比对照组分别提高了16.1%(P0.05)和8.4%(P0.05),Hsp70蛋白比对照组分别提高了12.4%(P0.05)和11.6%(P0.05)。 综合试验结果表明: (1) IUGR可导致仔猪体重和器官重量减轻,损伤肠道结构形态,并损害仔猪免疫细胞的增殖和细胞因子的分泌功能,导致仔猪早期免疫缺陷。 (2) IUGR可诱导新生仔猪肠道黏膜Hsp70基因和蛋白的表达。过表达的Hsp70可能损伤NF-κB信号通路,从而降低肠道免疫细胞增殖和细胞因子分泌的功能;此外,过表达的Hsp70可能促进FoxO3a表达,而高水平的FoxO3a可促进肠上皮细胞凋亡,从而损伤肠道黏膜免疫功能和肠道消化吸收功能。 (3)IEC-6细胞中Hsp70基因沉默可提高IKK活性,促进I-κBα的降解,增加NF-κB的核移位,同时抑制FoxO3a的表达,从而减少IEC-6细胞凋亡。相反,过表达的Hsp70可抑制IKK活性,减少I-κBα的降解,阻碍NF-κB的核移位,并提高FoxO3a的表达,从而增加IEC-6细胞凋亡。 (4)G1n能提高断奶仔猪生产性能,改善仔猪肠道黏膜形态功能,抑制促炎性细胞因子而提高抑炎性细胞因子的表达,同时,诱导肠道Hsp70表达而保护肠上皮细胞免受损伤,对IUGR仔猪出生后的追赶生长具有重要意义。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S828.5

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【参考文献】
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