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《南京农业大学》 2012年
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黄瓜—酸黄瓜渐渗系抗蔓枯病的资源鉴定、遗传分析及主效QTLs定位

娄丽娜  
【摘要】:由真菌Didymella bryoniae导致的葫芦科蔓枯病,可危害黄瓜的茎、叶、花、果实、种子及根。随着全球贸易的发展,蔓枯病已经发展成为一种全球性真菌病害.然而,对于田间发病的植株,蔓枯病菌常与其它真菌性病害伴生,导致其鉴定分离及防治的困难。前人的研究表明,黄瓜栽培种中缺乏优异稳定的蔓枯病抗性资源。且由于黄瓜遗传基础狭窄,极大地限制了蔓枯病抗性基因的发掘。黄瓜近缘野生种中蕴藏着大量的优异基因,对蔓枯病抗性表现良好。因此,通过种间渐渗的途径,发掘和利用黄瓜近缘野生种中的蔓枯病抗性基因,对于改良栽培黄瓜的抗性、良种繁育和生产的可持续发展都具有重要的意义。 从田间感病黄瓜植株上分离纯化获得了5份真菌样本,经过形态学、致病力及分子鉴定,确定了这5份真菌的归属;采用蔓枯病原菌A1为接种茵,对53份黄瓜近缘野生种Cucumis hystrix与华北型栽培黄瓜‘北京截头’的种间杂交渐渗系和10份不同生态型栽培黄瓜为试材进行蔓枯病抗性筛选;在此基础上,通过对不同抗性水平的4份渐渗系和3份栽培种的半双列杂交试验,进行配合力分析;构建了抗性渐渗系HH1-8-1-2与感病栽培种‘8419’的三个F2分离群体,开展了对渐渗系蔓枯病抗性基因的遗传规律、数量性状位点(QTL)定位及候选基因功能预测等方面的研究,主要结果如下: 1.蔓枯病原真菌及共侵染真菌的形态学、致病性及分子学鉴定 从表现蔓枯病症状的黄瓜植株上,分离和鉴定了五个病原真菌,编号分别为:N1、Q1、3-16、8102以及HH。在栽培黄瓜品系‘P02’上,对分离菌株的致病性鉴定表明:A1和N1为致病性最强的菌株。通过与已知D. bryoniae菌株(A1、T2和A)的分生孢子形态学比较,可以把N1归为D. bryoniae.通过核糖体序列间隔区ITS1和ITS2的序列分析,进一步证实N1与对照菌株A1和TMK-2都属于D. bryoniae.为证实其它四个菌株的菌属,对分离菌株的ITS序列在NCBI数据库中进行同源比对,获得了56个同源序列。经过系统分析,所有的序列被归为六个组群。基于56个已知序列,把N1、A1和TMK-2被归为D. bryoniae;菌株A属于Phoma sp;HH属于Alternaria sp;8102属于Corynespora cassiicola;3-16属于Arthrinium sp; Q1属于Plectosphaerella cucumerina. 设计了特异引物,用于鉴别D. bryoniae和Phoma sp、Arthrinium sp、C. cassiicola、 P. cucumerina以及Alternaria sp。通过ITS序列比对,菌株A与其它蔓枯病病菌相比,有2个碱基位点的缺失,可以用来作为其鉴别的特异性标记。对南京地区造成蔓枯病症鉴定困扰的优势病原真菌的鉴定,将有利于目标育种及病害防控。 2.黄瓜.酸黄瓜渐渗系蔓枯病抗性鉴定研究 采用苗期人工接种鉴定的方法,筛选出4份抗蔓枯病渐渗系(HH1-8-1-2、 HH1-8-1-16、HH1-8-5和BC1F5CT-01-2)、1份抗蔓枯病栽培黄瓜(‘津优10号’)、1份稳定感蔓枯病渐渗系(HH1-8-57)和3份感蔓枯病栽培黄瓜(‘8419’、‘新泰密刺’和‘津春4号’)。相关性分析表明:茎、叶蔓枯病抗性不相关;渐渗系在不同的季节抗性表现稳定。农艺性状的观察结果显示:HH1-8-1-2果刺色为褐色,介于野生种的黑色果刺和栽培种的白色果刺之间,证明其为种间杂种的后代。3.黄瓜.酸黄瓜渐渗系蔓枯病抗性的配合力及遗传分析 蔓枯病抗性的一般配合力(GCA)和特殊配合力(SCA)分析结果表明:GCA差异显著,SCA差异不显著,说明加性基因效应在控制GSB抗性上具有重要作用;HH1-8-1-2、HH1-8-57和‘8419’与其他亲本的一般配合力较好;CC3-CC2与HH1-8-57的特殊配合力显著;GSB侵染较少的组合亲本之一具有较高或者高的负向GCA效应;在传统育种方法中,使用高抗或中抗的亲本,能够改良黄瓜蔓枯病抗性。 遗传分析的结果表明:2009F2(HH1-8-1-2×'8419')、2009F2'('8419'×HH1-8-1-2)和2010F2(HH1-8-1-2×'8419')三个群体的广义遗传率分别为73%、75%和49.9%。基于分离群体蔓枯病病级有一个主峰偏向抗性亲本的近正态分布特征,推测抗蔓枯病渐渗系HH1-8-1-2的抗病遗传规律为数量性状控制的主基因+多基因遗传。 4.黄瓜-酸黄瓜渐渗系蔓枯病抗性主效QTL的定位 基于已构建的两个渐渗系插入片段分布图谱,通过分析渐渗系群体中蔓枯病抗性株系的渐渗片段在基因组上的重叠区,发现六个潜在的蔓枯病抗性QTLs位点,分布在第一、第四和第六染色体上,分别为GSB1a、GSBlb、GSB4a、GSB4b、GSB6a和GSB6b。 利用简单重复序列(SSR),在所鉴定的QTL的目标区段,构建了两个遗传连锁群,分别为第四染色体上的连锁群1和第六染色体的连锁群2,长度分别为12cM和44cM,标记间平均距离分别是1.5cM和2.44cM。经过连锁分析,染色体四上的QTL定位区段为SSR26165-SSR04534、SSR04649-SSR17459和SSR17459-SSR04454;染色体六上的QTL定位区段为SSR21115-SSR19755和SSR19755-SSR12510。 5.黄瓜-酸黄瓜渐渗系蔓枯病抗性候选基因的功能预测 根据遗传定位结果,结合显著性标记的物理定位,将蔓枯病抗病基因定位于第四和第六染色体的3.569Mbp和1.299Mbp基因组DNA区段。通过对目标区段基因的注释和功能分析,分别在第四和第六染色体上推测出33个和24个可能与蔓枯病抗性相关的候选基因。为后续GSB抗性基因图位克隆及抗病分子机制的研究奠定了基础。
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