四倍体栽培棉种高密度遗传图谱的加密及棉花红株R_1和茸毛T_1基因的精细定位

【摘要】：棉花是世界性重要的经济作物之一,棉纤维的品质和色彩可以大大提升其经济价值。高密度的遗传图谱是植物基因组研究的基础。可有效阐明基因组的结构特征,为重要性状基因的精细定位和图位克隆奠定基础。棉花叶片密生茸毛和红株性状均由单显性基因控制。叶片中茸毛的发育不仅与棉纤维发育有相似之处,而且多毛具有抗虫特性。红叶中决定色素形成的基因可有效用于培育天然彩棉的育种实践中。精细定位这2个关键基因,获得其候选相关基因,进而进行结构、表达及系统进化分析,不仅可阐明其作用机理,而且可为棉花纤维品质改良、抗虫育种及天然彩棉的培育提供重要基因资源。本研究在前人构建海陆棉花种间遗传图谱的基础上,进一步开发和利用棉花新标记,进行图谱加密和染色体结构特征分析；利用加密的图谱信息,完成棉花茸毛及红株两个质量性状基因T1和R1的染色体精细定位和其候选基因的初步分析；结合已释放的不同棉种EST及基因组序列信息,进行棉花WRKY类家族基因的全基因发掘、鉴定、分类和表达初步分析。主要研究结果如下： 1、高密度海陆种间遗传图谱的构建及基因组结构分析 本研究利用新开发的gSSR引物及网上公开释放的部分CER、CGR、COT、DC、 DPL、SHIN及HAU编号的引物,与已开发的SSR标记位点进行冗余筛选,获得1431对非冗余引物,在作图亲本TM-1和Hai7124之间筛选多态性,进而完成图谱的加密工作。新获得的海陆栽培棉种种间遗传图谱包含3414个位点,总长为3677.6cM,标记间的平均距离为1.08cM,分布在26条连锁群上。 该图谱上包含941个重复位点,分别由425对引物在亲本TM-1和Hai7124间扩增产生。这些重复位点主要来源于SSR、REMAP、SRAP、AFLP、RT和In-Del等5种标记类型。其中326对SSR引物产生693个重复位点,包括287对SSR引物产生2个位点；37对产生3个位点；2对产生4个位点。分析这些重复位点的染色体分布,除位于部分同源染色体上的重复位点外,一些重复位点位于同一染色体上,另一些重复位点位于非同源的不同染色体上,表明在四倍体棉花进化进程中基因组染色体内部及染色体间发生了复制和重排等结构变异。 新构建的遗传图谱上含86个位点簇(≥5loci/cM),涉及617个位点。除Chr.1上未发现位点簇外,这86个位点簇分布在其余25个连锁群上,分布密度不均匀。其中,31个位点簇分布在At亚组上,涉及到229个位点；55个位点簇分布于Dt亚组上,涉及到388个位点。同时也检测到19个基因岛(≥5EST-SSR loci/cM)和1个反转录转座子区(≥5REMAP loci/cM). 300个位点在作图群体中不符合孟德尔遗传规律(P0.05)。在连锁群上构成12个偏分离富集区,At亚组和Dt亚组各分布6个。这12个偏分离富集区分布在11条染色体上,其中在Chr.20上有两个偏分离富集区。在偏分离富集区上位点的偏向保持着一致性,其中8个偏向于亲本TM-1,4个偏向于杂合子。 2、两个质量性状基因的精细定位和候选基因筛选 以构建的高密度海陆种间遗传图谱为基础,分别利用(Sub16×T586)F2群体和[(Hai7124×T586)xHai7124]BC1群体,完成棉花两个重要的质量性状基因一红株R1和茸毛乃基因的精细定位。将红株R1基因定位在第16染色体标记NAU4956和NAU6752之间,遗传距离分别为2.91cM和0.49cM;将茸毛乃基因定位在第6染色体NAU5434与NAU1277之间,距最近标记NAU5434的遗传距离为0.6cM. 基于精细定位的结果和网上公开释放的棉花D基因组雷蒙德氏棉种的基因组序列信息,根据目标基因附近的标记序列映射雷蒙德氏棉基因组序列,获得目标基因所在的候选物理区域。利用Fgenesh程序对候选的物理区域进行ORF预测及BLAST2Go的功能注释及代谢特征分析,结合所克隆基因作用特征完成候选基因的确定及功能初步分析。针对色素合成代谢途径特点,筛选了6个候选基因,分别命名为RG1-RG6;参考前人拟南芥表皮毛发育研究结果,初步确定标记映射区域与棉花密生茸毛性状相关的6个候选基因,分别命名为TGI-TG60 形态及扫描电镜分析显示,随着叶龄发育,T586的叶片色素沉积越来越多叶片茸毛的发育随着叶龄发育逐渐变稀,但每一发育阶段,T586的叶片茸毛均显著高于Hai7124,在成熟叶片上,Hai7124仅叶脉及叶边缘可见茸毛分布,而T586叶片密被茸毛。选择T586和Hai7124不同叶龄的棉花叶片(叶芽、幼叶及成熟叶),进行候选基因的表达分析。Q-PCR分析表明,在控制棉花红株性状的6个候选基因中,基因RG4在T586色素沉积最多的成熟叶中,其表达量显著高于同时期Hai7124叶片中的表达量,而其他候选基因在两个亲本材料色素差异最明显时期叶片中的表达量都没有达到显著水平。在控制茸毛性状的6个候选基因中,基因TG5在T586叶片每一发育阶段的表达量与Hai7124之间均存在显著或极显著差异。同时,随着叶片的发育,在T586和Hai7124中表达水平也随之降低,与叶片表皮茸毛密度分布特征一致。其余候选基因的表达未发现规律性。综合基因表达、表型变化及扫描电镜分析结果,推测RG4和TG5是控制两个质量性状红株R1和茸毛T1的候选基因。根据BLAST2Go(?)勺功能注释表明,RG4是一个编码八氢番茄红素合酶的基因；TG5为一个bHLH类型的转录因子。 3、棉花WRKY转录因子家族全基因组分析 已有研究报道,WRKY转录因子家族参与植物的生长发育、衰老等进程,同时对各种生物胁迫和非生物胁迫都有一定的响应。在拟南芥中,AtWRKY44参与了拟南芥表皮毛形成。为了阐明WRKY转录因子家族在棉花重要性状形成中的可能角色,我们开展了WRKY转录因子家族棉花全基因组的发掘、鉴定、分类和表达初步研究。 利用在NCBI上公开释放的棉花EST序列,结合Pfam数据库提供的WRKY转录因子种子文件的全部2450条种子序列,比对棉花总EST数据库,最终得到535条WRKY类EST序列。以这535条EST序列作为探针,通过电子克隆技术,获得95个含有WRKY结构域的Contig,其中74个Contig中至少含有一个完整的WRKY结构域,暂命名为Contig1-Contig74。与拟南芥WRKY转录因子家族的进化分析显示,74个Contig属于3个组及5个亚组,其中3个组-Group Ⅰ、Group Ⅱ和Group Ⅲ,分别含有16、49和9个Contig。Group Ⅱ的五个亚组--Group Ⅱ a、Group Ⅱb、Group Ⅱc、 Group Ⅱd和Group Ⅱe分别含有5、2、25、12和5个Contig。 利用公布的雷蒙德氏棉全基因组序列草图,进一步对雷蒙德氏棉全基因组进行了WRKY转录因子家族成员的预测,共得到109个WRKY转录因子家族成员。分子进化分析将该转录因子家族成员分为3大类,其中Group Ⅰ有19个成员,Group Ⅱ有78个成员,Group Ⅲ有12个成员。进一步与来源于拟南芥的WRKY家族基因聚类结果分析,将Group Ⅱ分成Group Ⅱa、Group Ⅱb、Group Ⅱc、Group Ⅱd和Group Ⅱe五个亚组,每个组成员分别有7个、15个、29个、15个和12个。通过序列比对,发现有5个成员在WRKYGQK的保守结构域上存在有WRKYGKK的变异,分别是GrWRKY31、 GrWRKY39、GrWRKY46、GrWRKY35和GrWRKY78,并且这5个成员都属于Group Ⅱc亚组；在Group Ⅱc中的GrWRKY8还存在WRKYGHK结构域变异。除了在WRKYGQK的保守结构域上存在变异,在Group ⅠN、Group ⅠC和GroupⅢ中发现WRKY家族成员在锌指结构上也存有一定的变异。 通过序列相似性比对来自棉花EST数据库和雷蒙德氏棉基因组的WRKY转录因子,前期预测的74个Contig中,除属于Group Ⅱc亚组的Contig69、70、71和73等4个Contig外,70个Contig h(?)在二倍体D基因组雷蒙德氏棉中找到高度相似的同源序列。推测4个未找到同源序列的Contig可能是四倍体棉种在进化过程中获得的新基因或是At亚组专有的WRKY转录因子。 从陆地棉TM-1基因组中克隆获得GhWRKY19、 GhWRKY23、GhWRKY60、 GhWRKY87、GhWRKY95等5个成员全长ORF的基因组信息。其中,GhWRKY19ORF全长为1401bp,编码466个氨基酸,含有4个内含子；GhWRKY23ORF全长为942bp,编码313个氨基酸,含有4个内含子；GhWRKY60ORF全长为1068bp,编码355个氨基酸,含有2个内含子；GhWRKY87ORF全长为807bp,编码268个氨基酸,含有2个内含子；GhWRKY95ORF全长为966bp,编码321个氨基酸,含有2个内含子。不同组织、器官表达特征表明,WRKY类基因在根茎叶等营养器官中的表达量普遍高于在棉纤维中的表达量。GhWRKY38在根中高表达；GhWRKY19、GhWRKY87和GhWRKY43在叶中高表达；GhWRKY74在根和茎中高表达；而GhWRKY21和GhWRKY60在根和叶中高表达。在纤维发育进程中高表达的WRKY家族成员主要检测到GhWRKY19、GhWRKY21和GhWRKY23,其高表达的时期集中在-3dpa-5dpa,没有检测到在纤维发育后期高表达的基因。 以陆地棉抗逆品种晋棉19三叶期幼苗为试验材料,进行水杨酸(2mM SA)、茉莉酸甲酯(100μM MeJA)、脱落酸(200μM ABA)、赤霉素(500μM GA)、盐(200mM NaCl)、干旱(20%PEG6000)、乙烯(5mM ET)等非生物胁迫处理,分析WRKY类基因在非生物胁迫诱导0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h后的表达水平。结果表明：GhWRKY23、 GhWRKY43、GhWRKY60、GhWRKY74和GhWRKY87被上述七种胁迫处理诱导后表达显著提高。GhWRKY19在PEG和ET处理后,表达水平未发生显著变化,而GhWRKY21和GhWRKY38不被盐胁迫诱导。