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《南京农业大学》 2011年
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转基因饲料中bar基因检测方法的研究

李风翠  
【摘要】:从Streptomyces hygroscopicus(?)吸水链霉菌)中分离得到的bialaphos resistance gene(Bar基因)被证明具有良好的抗除草剂效果,用转基因育种的方法将Bar基因导入到作物中培育了抗除草剂的转基因作物(如棉花、玉米等),随着抗除草剂转基因作物种植面积的增加,且越来越多地应用到动物饲料中,Bar基因可能间接地随着动物性产品进入人类食物链,由于转Bar基因饲料的安全性问题目前仍不明确,急需对转Bar基因饲料进行检测并标识,保护使用者对转Bar基因饲料的知情权。本研究即以检测饲料中是否含转Bar基因为目的,分别从基因和蛋白水平建立快速便捷的检测方法。 1、检测饲料中转Bar基因实时荧光定量PCR方法的研究。根据NCBI中已发表的Bar基因序列设计引物和探针,通过对试验条件的优化和对人工模拟混合饲料样品的检测,建立了能检测转Bar基因成分为0.5%的饲料样品,说明本试验建立的实时荧光定量PCR方法适用于对转Bar基因饲料的检测。 2、检测饲料中转Bar基因产物PAT蛋白的免疫胶体金层析试纸条方法的建立。Bar基因编码的膦化麦黄酮乙酰转移酶(PAT),能分解除草剂中的有效成分草丁膦(PPT),起到抗除草剂的作用。用DNAStar生物学分析软件对Bar基因编码PAT蛋白的氨基酸序列进行分析,预测其潜在的抗原表位,并合成了六条潜在抗原表位多肽,通过免疫Balb/c小鼠获得抗体,筛选出具有抗原表位的多肽,得到编码抗原表位的基因片段。通过编码柔性氨基酸的DNA序列将基因片段连接,重组Bar基因,并加入BamHI、XhoI酶切位点。将重组Bar基因与原核表达载体pGEX-6P-1连接,构建重组质粒pGEX-6P-1-CBG544.经限制性酶切、PCR和测序验证正确后,将重组质粒pGEX-6P-1-CBG544转化大肠杆菌表达,经IPTG诱导,表达产物主要以包涵体的形式存在,蛋白相对分子量约为46kD,将包涵体离心、洗涤和亲和层析纯化,获得了高纯度重组蛋白pGEX-6P-1-PAT。用重组的pGEX-6P-1-PAT蛋白免疫日本大耳白兔获得的抗体,经纯化、鉴定,得到了纯度较高的抗重组PAT蛋白的抗体。 用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒并标记抗重组PAT蛋白的抗体,获得金标抗体,将其包被在玻璃纤维上,并将抗体(检测线)和羊抗兔IgG(质控线)分别包被在硝酸纤维素膜上,按顺序组装胶体金快速检测试纸条。以人工模拟混合饲料样品作为检测对象,并与检测PAT蛋白的ELISA试剂盒进行比较。结果证实胶体金试纸条可检出含1%的转Bar基因人工模拟动物饲料。检测快速、简便,适用于对转Bar基因饲料进行现场筛选和检测。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S816

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【参考文献】
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