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《南京农业大学》 2012年
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西瓜枯萎病拮抗菌的筛选、生物学特性及发酵条件和抗生物质的研究

王晓晓  
【摘要】:由于同一作物、同一地块长期连作,产生产量降低、品质变劣、病害加重等现象称之为连作障碍。引起连作障碍的主要原因是连作土壤中微生物多样性下降,细菌及放细菌数量减少,土传真菌病原菌大量繁殖。西瓜枯萎病是目前西瓜生产中最重要的土传病害,影响最大,防治最困难。因此,研究西瓜枯萎病的防治对西瓜生产具有重大的意义。利用有益微生物或拮抗微生物对西瓜枯萎病进行生物防治,抑制西瓜尖孢镰刀菌的生长繁殖,控制西瓜枯萎病的发生,是一种很有前景的生物防治方法。 通过系列稀释涂布平板、对峙培养等方法,从长期连作的健康西瓜的根际土壤中分离筛选得到两株西瓜枯萎病拮抗细菌菌株N8和H11,通过形态特征、生理生化特征及16SrRNA基因序列相似性分析,将其初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis). 菌株N8和H11在pH值5.0-7.0范围内生长良好。菌株N8最适生长pH为5.0,摇瓶培养21h时到达稳定期;菌株H11最适生长pH为6.0,摇瓶培养18h时到达稳定期。菌株N8和H11的最适生长温度均为35℃,最佳装液量为75mL/250mL,最佳接种量为5%。菌株N8和H11对氨苄青霉素均有抗性;对常见的化学农药具有广泛的耐受性。 拮抗菌株N8产生的抗菌活性在pH为5.5时最强,H11产生的抗菌活性在pH为5-5.5时最强。温度对N8和H11产生的抗菌活性影响都不大,在3pH9的范围内抗菌活性均比较稳定,但强酸强碱环境中抗菌活性都明显下降,即在强酸强碱环境中抗菌活性不稳定。拮抗菌株N8和H11及其发酵液对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani Kuhn)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici Leonian)、辣椒黑点炭疽病菌(Vermicularia copsici)、玉米小斑病菌[Bipolaris maydis (Nishik.Miyabe)shoem.]、黄瓜蔓枯病菌(Mycosphaerella melonis)及稻瘟病菌[Magnaporthe grisea (Hebert)Barr]均具有较强的拮抗能力,抑菌圈均在25mm以上,说明两菌株均具有广谱性,在生物防治方面有一定的应用潜力。 经过液体发酵培养,以一定量的除菌发酵滤液对西瓜枯萎病菌的抑制率作为判定抗菌活性的主要指标,筛选出培养基B为菌株N8和H11产抗生物质最适的初始培养基;对培养基B各成分及无机盐组成进行优化,确定正交优化后的培养基成分为:马铃薯200g,蔗糖20g,蛋白胨5g,硫酸铵3g,磷酸二氢钾2g,水1000mL。采用不同的培养温度、pH、培养时间及不同的通气量对菌株N8和H11进行发酵培养,对其发酵液进行抗菌活性检测,确定菌株N8产生抗生物质的最佳培养条件为:初始pH为6,接种量为5%,装液量为50mL/250mL,发酵周期为48h,温度为30℃时,抗菌活性达到最大值,抑菌率为78.43%;H11产生抗生物质的最佳培养条件为:初始pH为6,接种量为5%,装液量为50mL/250mL,发酵周期为72h,温度为30℃时,抗菌活性达到最大值,抑菌率为72.55%。 拮抗菌株N8所产生的抗生物质属于胞外分泌型,可以溶解于乙醇等有机溶剂中,通过调节pH值、有机溶媒沉淀、硅胶薄层层析可以分离纯化得到抗生物质。 盆栽试验发现,拮抗菌株N8和H11及另外一株拮抗放线菌对西瓜枯萎病具有明显的防治作用,防治率分别为76.46%、57.65%和61.09%;拮抗菌株配合施用有机肥与其单独施用相比,防治效果明显提高,防治率在单独施用的基础上又提高10%以上,而且有机肥兼有促生作用。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S436.5

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【参考文献】
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