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仔猪后肠中抗性淀粉降解的微生物机制

李博  
【摘要】:近年来,人们日益关注动物的肠道健康,因为肠道健康一定程度上决定了动物的健康。猪肠道特别是后肠中大量的微生物能够发酵各种底物产生挥发性脂肪酸,其中丁酸对肠粘膜细胞正常生长和发育起重要作用,并且可以预防和治疗后肠疾病。诸多研究表明,摄入抗性淀粉能够促进后肠丁酸的产生。但由于抗性淀粉在产生丁酸的过程中,有大量肠道菌群参与,并且这一过程所经历的代谢途径较多,同时还伴随着时间和空间的复杂变化,因此,目前我们对抗性淀粉产生丁酸的过程尚不十分清楚。不同种类淀粉在后肠发酵有何差异?肠道菌群的不同对于发酵抗性淀粉有何影响?在发酵过程中菌群变化是怎样的?发酵过程中的中间产物对于促进丁酸产生有何影响?能够降解抗性淀粉的菌都有哪些?为探究上述问题,本论文以仔猪为实验动物,结合厌氧体外发酵技术,亨氏滚管厌氧分菌技术和16S rRNA基因分子生态技术,对抗性淀粉产丁酸过程的微生物机制进行了研究。 本论文研究部分主要分为三章: 一、体外发酵比较猪后肠微生物对支链淀粉和抗性淀粉的降解 为了比较猪后肠微生物对支链淀粉和抗性淀粉降解,本章以两种抗性淀粉(RS2和RS4)以及易消化淀粉——支链淀粉为底物,利用断奶仔猪结肠食糜为接种物进行体外发酵,研究了不同种淀粉之间发酵特性的差异。同时,还比较了结肠食糜和盲肠食糜对抗性淀粉RS2体外发酵的差异。结果表明,支链淀粉最易于被仔猪结肠微生物发酵,体外发酵累计产气量、发酵液的挥发性脂肪酸浓度均显著高于抗性淀粉组,发酵液pH值显著低于抗性淀粉组。以支链淀粉和抗性淀粉RS2为底物发酵产生乳酸浓度变化相似,发酵6h内浓度显著升高,而后逐渐下降。结果还表明,抗性淀粉RS4不能被微生物降解。比较盲肠和结肠接种物发酵抗性淀粉RS2发现,盲肠接种物发酵产乳酸的速度较结肠接种物慢,而挥发性脂肪酸变化则没有显著差异。 二、16S rRNA基因分子技术分析仔猪粪样发酵抗性淀粉过程中菌群变化 本章实验分为两部分内容,第一部分:采用DGGE和Real-time PCR技术,对结肠粪样体外发酵支链淀粉和抗性淀粉,以及盲肠粪样体外发酵抗性淀粉发酵过程不同时间点发酵液的菌群进行16S rRNA基因分子技术分析。结果表明,结肠粪样发酵6h抗性淀粉组与支链淀粉组各时间点菌群相似性较高,达到80%以上,但发酵中后期相似性逐渐降低,到第24h仅为70%。比较结肠和盲肠接种物发酵抗性淀粉发现,图谱中大多数条带为两个肠段发酵样品共有,其中最优势条带A被鉴定为Subdoligranulum variablie (99%),发酵12h和24h在两组样品中均出现新条带B和C,它们均被鉴定为Blautia producta (99%). Real-time PCR定量分析表明,结肠发酵支链淀粉与结肠发酵抗性淀粉总菌的数量在发酵中后期(12h和24h)差异显著(P0.05),拟杆菌数量在整个发酵过程中差异显著(P0.05),但梭菌Ⅳ群和双歧杆菌并不显著。结肠发酵抗性淀粉和盲肠发酵抗性淀粉组相比较,在发酵6h时总菌、拟杆菌、梭菌Ⅳ群均具有极显著差异。各组发酵液中双歧杆菌数量在整个发酵过程中一直处于上升趋势,但各组之间差异不显著。第二部分:采用平板涂布和亨氏滚管方法对淀粉降解菌进行厌氧分离,并对所分离菌株进行16S rRNA基因序列测序,对其鉴定。实验分离到30株淀粉降解菌,通过与基因库数据进行比较,排除重复菌株,最终得到下列13株菌:菌株1, Clostridium perfringens;菌株2, Escherichia coli;菌株4, Streptococcus suis;菌株6, Anaerovibrio lipolyticus;菌株8, Bacillus licheniformis;菌株10,Streptococcus caballi;菌株12, Streptococcus lutetiensis;菌株64,Clostridium butyricum;菌株65, Prevotella buccae;菌株70, Enterococcus canintestini',菌株74, Clostridium glycolicum;菌株75, Ruminococcus gnavus和菌株33, Streptococcus bovis。根据菌落降解抗性淀粉产生的水解圈,判断菌株1、4、12、65和33可能是通过释放胞外酶的方式降解抗性淀粉;菌株2、8、64、70、74和75可能是通过紧密结合淀粉粒的方式降解淀粉;而菌株6和10仅在支链淀粉为唯一底物的培养基中出现,因此认为它们仅能够降解支链淀粉。 三、体外发酵比较仔猪粪样微生物对L型乳酸和D型乳酸的利用特性 本实验首先测定了长白妊娠母猪,长白仔猪和梅山仔猪结肠粪样中L型和D型乳酸的含量。在此基础上,以仔猪粪样为接种物,以不同浓度(5和25mmol/L浓度)L型乳酸、D型乳酸和L、D型混合乳酸为底物,研究仔猪粪样微生物发酵L型乳酸和D型乳酸的特性。结果表明:结肠粪样中乳酸含量个体差异较大(0.54±0.26mg/g),品种和年龄对乳酸含量无显著影响。体外发酵研究表明,仔猪粪样微生物在5mmol/L浓度下对L型乳酸和D型乳酸利用速度无显著差异,而在25mmol/L浓度下,对L、D型混合乳酸利用速度最快,L型次之,D型最慢,发酵48h后,各型乳酸均被完全利用。仔猪粪样菌群发酵L型和D型乳酸主要产生乙酸和丙酸,尤其在不同浓度组别比较情况下,丙酸的产生量和底物浓度具有相关性。在发酵过程中,L、D型混合乳酸产气量较同浓度单一乳酸有较多的趋势。 本文的结果对了解抗性淀粉在单胃动物后肠中的降解规律提供了理论依据:抗性淀粉能够在后肠中被缓慢消化。在进一步的研究中,可以选择淀粉抗性不同的几种日粮配方,通过猪在体试验对抗性淀粉在肠道内的降解,及其对腹泻等疾病的预防进行研究。并进一步了解不同日粮组成在后肠降解的速率。同时,对于乳酸降解的相关试验,可以通过改变培养基配方的方法,在为菌群提供丰富营养物质的前提下了解乳酸降解产物。


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