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《南京农业大学》 2012年
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甜椒CMS育性相关基因的分子标记筛选与应用

吴国平  
【摘要】:辣椒(Capsicum annuum L.)是中国第二大蔬菜作物,栽培面积仅次于大白菜。辣椒作为常异花授粉作物,具有很强的杂种优势,优良一代杂种比常规种一般能够增产30%-50%。利用辣椒细胞质雄性不育系生产一代杂交种,可以省去人工去雄手续,简化制种程序,提高种子纯度等。辣椒细胞质雄性不育的研究一直受国内外广泛重视,利用细胞质雄性不育配制杂交种也成为了当今世界甜辣椒育种的热点。本研究以甜椒胞质雄性不育恢复系5-2R1和相应的保持系5-2为试材,利用SRAP、SCAR标记技术,以期筛选与甜椒CMS恢复基因相关的SRAP标记以及SCAR标记,利用SCAR特异引物对多份甜辣椒材料进行恢复基因验证,并对含有恢复基因的材料进行田间育性恢复调查;结合SRAP分子标记技术,比较分析甜椒细胞质雄性不育系CMST6A及其相应的保持系T6B的基因组差异,筛选与甜椒不育基因相关的特异片段。主要研究结果如下: 1.甜椒胞质雄性不育恢复基因的SRAP及SCAR标记分析 以甜椒胞质雄性不育恢复系5-2R1和相应的保持系5-2为试材,利用SRAP分子标记技术筛选与甜椒恢复基因相关的分子标记。128对SRAP引物组合共扩增获得了3796条从100bp至800bp大小不同的条带,平均每对引物组合可扩增出30条清晰的条带,共检测到4个多态性位点,其中恢复系材料仅有1个。对该特异片段进行回收、克隆和测序,结果表明该片段全长为259bp。经BLAST比对分析表明,该片段与烟草线粒体中的NADH脱氢酶第5亚基(GenBank:EF151914.1)具有81%的同源性;同时,该片段与辣椒BAC克隆PEPBAC158K24(GenBank:FJ597540.1)的部分序列高度同源。根据序列特点设计特异SCAR220引物,对恢复系和保持系进行扩增验证,仅在恢复系中扩增出目的条带,表明已成功地将此SRAP标记转化为简单、稳定的SCAR标记。我们推测本研究获得的SCAR220标记可能与胞质雄性不育恢复基因相关。 2.甜椒恢复基因SCAR220标记的应用 本文采用SCAR220标记对国内外引进的96份辣椒材料和34份甜椒材料进行分析,其中在32份甜(辣)椒材料中扩增出了220bp大小的特异条带。以上述130份甜(辣)椒材料和辣椒细胞质雄性不育系21A以及辽A为试材进行杂交,并对其杂交后代的育性进行田间鉴定。结果表明,96份辣椒材料中,有21份检测到了特异条带,但是仅有6份具有育性恢复能力,其中4份材料得到了SCAR220标记验证;14份转育的甜椒恢复系材料中,有8份检测到了特异条带;另外20份甜椒材料中,有3份材料扩增出了特异条带,但是仅有1份具有育性恢复能力,并且得到了SCAR220标记验证。说明恢复基因SCAR220标记具有一定的稳定性,可用作甜椒恢复系早期筛选手段之一。 3.甜椒细胞质雄性不育基因的SRAP标记 旨在筛选出甜椒细胞质雄性不育基因连锁的SRAP标记,为进一步深入研究甜椒细胞质雄性不育的分子机制奠定基础。本研究以甜椒细胞质雄性不育系CMST6A和相应的保持系T6B为试材,利用SRAP分子标记技术,筛选与甜椒雄性不育基因相关的特异片段。对特异片段进行回收、克隆和测序,并用blastn和blastx程序在NCBI数据库中进行同源性检索和相似性比对。128对SRAP引物组合共扩增获得了3844条100~1000bp的条带,平均每对引物组合可扩增出31条清晰的条带,共检测到3个多态性位点,其中不育系中仅有一个多态性条带,命名为CMS T6A201.用blastn程序进行核苷酸同源序列比较,此片段与Ty3-gypsy类逆转座子的部分序列高度同源;用blastx程序与蛋白质数据库进行同源性比对,由该片段推测的氨基酸序列与水稻假拟Ty3-gypsy逆转座子蛋白、蒺藜苜蓿的反转录酶、水稻gag-pol蛋白以及马铃薯的假拟gag-pol蛋白等相似性较高。由此推测,甜椒细胞质雄性不育系特异片段CMS T6A201的功能可能与逆转座子有关。
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