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《南京农业大学》 2013年
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鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及耐药性的初步研究

刁东雪  
【摘要】:鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌引起的主要侵害雏鸭、雏鹅等多种雏禽的一种接触性、败血性传染病。发病鸭主要是依靠抗菌药物进行治疗,但有报道常用的抗菌药物对鸭疫里氏杆菌的敏感性逐渐下降,但对相关的耐药机制仍缺乏较深入的研究,本论文以2010年江苏某鸭场分离鉴定的鸭疫里氏杆菌为研究对象,探讨了其对氯霉素类抗生素、氨基甙类抗生素和利福平的耐药性及其耐药机制。 本次试验首先从江苏某发病鸭场共采集疑似样品6份,对样品进行了鸭疫里氏杆菌的检测,试验从菌株形态、培养特性、生化特性及16S rRNA检测等方面对分离菌株进行鉴定;然后采用微量稀释法测定了15种抗菌药物对鸭疫里氏杆菌临床分离菌株的体外最小抑菌浓度(MIC);同时建立了PCR方法检测分离菌株中介导利福平、氯霉素、氨基糖苷类抗生素耐药的主要基因,对检测到的氯霉素cat耐药基因通过Southern杂交的方法进行定位,并对利福平rpoB基因进行突变位点的分析,对于检测到的氨基糖苷类耐药基因进行测序和序列比对;最后采用体外递增药物浓度的方法诱导出氟苯尼考耐药的里氏杆菌,并对人工诱导耐药菌株的敏感性、生长特性及耐药机制进行初步了研究。 实验结果显示:病鸭分离到的细菌经形态观察、选择性培养、生化特性测定及16SrRNA检测,可鉴定为鸭疫里氏杆菌;本次鸭场分离的鸭疫里氏杆菌对氟苯尼考全部敏感,但对大环内酯类、氯霉素、利福平、多黏菌素E、头孢曲松钠、四环素、氟喹诺酮类等药物均表现出一定程度的耐药;PCR检测到的氯霉素耐药基因主要为cat基因,应用Southern杂交方法检测该基因主要定位于染色体基因组上。通过测序以及与Genbank中的基因对比,发现对氨基糖苷类抗生素耐药的菌株主要检测到的耐药基因为aac和aadA。对利福平耐药的菌株主要分析了其rpoB基因,通过测序和与敏感株序列及NCBI登陆的相关序列进行对比分析,发现在4株利福平耐药菌株中,均存在rpoB基因的突变,其中1株菌的rpoB在357、358位有碱基C和G的插入,360位有碱基A的插入,导致出现Glu-Asp和Asp-His氨基酸的突变;1株菌的rpoB在517位点发生碱基突变(T-C),导致氨基酸Thr突变为Cys;另外2株菌的383位碱基突变(G-A),导致氨基酸由Arg突变为Lys。人工诱导的3株氟苯尼考耐药的鸭疫里氏杆菌对氟苯尼考的MIC值均高于64mg·L-1,且发现诱导菌株对红霉素的敏感性下降,部分菌株对红霉素的MIC达到128mg·L-1;生长曲线的测定结果显示:体外诱导的耐药株生长速度较亲本株较慢,临床分离亲本菌株的23S rRNA及核糖体蛋白L4及L22基因均未发生突变,而氟苯尼考诱导的3株菌中,未检测到相关的氟苯尼考耐药基因,但诱导耐药株与亲本株比较,均含有23S rRNA位点突变,其中1株耐药菌的23S rRNA出现了A2078G,A2304T和G2083T突变;1株耐药菌的23S rRNA出现了A2058T,A2126G和A2353T位点突变;1株耐药菌的23S rRNA出现了A2045T,A2577G突变,在诱导菌中出现的A2126G和A2353T突变未见报道;检测的3株耐药菌的核糖体蛋白L4、L22基因均未发生突变。本试验结果提示该鸭场分离的鸭疫里氏杆菌除对氟苯尼考保持敏感外,对其它常用抗菌药物均表现出一定程度的耐药,该结果可为该鸭场病鸭的临床治疗提供参考。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S852.61

【参考文献】
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