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《南京农业大学》 2013年
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小鼠支持细胞重编程为诱导多能干细胞的研究

孙红艳  
【摘要】:体细胞异位表达特异性转录因子可以重编程为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS细胞)。iPS细胞不仅具有与胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES细胞)相同的多能性和自我更新能力,还可以避免临床治疗过程中的免疫排斥和各种伦理道德问题。因此,iPS细胞技术不仅为科研基础理论研究提供了新的技术手段,也为再生医学领域带来了广阔的应用前嘛号。目前,尽管已经获得多种体细胞来源的iPS细胞,但不同来源的iPS细胞质量参差不齐,在基因表达图图谱,表观遗传修饰及分化能力等方面存在差异。因此,根据实验目的选择合适的体细胞是获得高质量、具有发育全能性的优质iPS细胞的前提。 小鼠支持细胞(Sertoli cells)是睾丸的重要组成成分,具有免疫豁免和为生精过程提供适宜微环境的作用。离体培养时,支持细胞增殖速度较快,生长状态良好,自身表达Klf4和c-Myc等基因。支持细胞分离纯化后可得到高纯度同质性细胞群,排除了异质性细胞群对重编程实验的干扰。因此,支持细胞重编程为iPS细胞为后续诱导生精细胞提供源细胞。 一氧化氮(nitric oxide, NO)是细胞内信号分子,参与干细胞生长增殖调控。NO对干细胞调控呈浓度依赖性,高浓度NO促进干细胞分化,低浓度NO维持干细胞多能性。探索NO对iPS细胞的影响对iPS细胞长期体外增殖分化有重要作用。 本实验主要目的是将小鼠支持细胞重编程为iPS细胞并探索NO对iPS细胞的影响。分为以下方面:逆转录病毒载体的扩增与检测;支持细胞的分离培养及纯化;逆转录病毒液获得及感染支持细胞;iPS克隆获得及鉴定;低浓度NO对iPS细胞的影响。主要研究结果如下: 1.酶切和测序鉴定证实了扩增的逆转录病毒载体的准确性。 2.获得高纯度小鼠支持细胞:通过两步酶消化法从小鼠睾丸中分离支持细胞,并且通过密度梯度离心法及差速贴壁法纯化小鼠支持细胞。原代培养的小鼠支持细胞具有良好的生长状态,SGP-1、SGP-2、Transferrin、ABP及AMHII等支持细胞特异性标记物表达,Klf4和c-Myc表达水平较低,Nanog、Sox2及Oct4等多能基因不表达。 3.成功构建小鼠支持细胞iPS细胞系:将四种重编程因子导入支持细胞,同时以GFP空载体检测病毒感染情况。感染的支持细胞在3d左右表达GFP。同时细胞开始缩小聚集,失去原有支持细胞形态,逐步形成突起样克隆,18d左右感染的支持细胞不表达GFP荧光,形成具有典型干细胞特性的iPS细胞。iPS细胞可以体外长期增殖并保持正常核型。 4.iPS细胞系鉴定:iPS细胞AKP染色呈阳性,可表达多种ES细胞特异性基因,发Nanog、Oct4、Sox2、Rex1、Fbxl5、E-cad和Fgf4等,并且表达水平与ES细胞相近;Nanog和Oct4免疫染色呈阳性。在细胞周期调控模式上,iPS细胞与ES细胞相近。重编程的iPS细胞内源多能基因激活,外源转录基因沉默。同时,iPS细胞具有分化为多种细胞的能力。体外培养时,可形成拟胚体,获得的拟胚体可分化为三个胚层细胞,同时自发分化为跳动的克隆团;体内培养时形成畸胎瘤,畸胎瘤经HE染色后可以观察到不同胚层的组织衍生物。 5.低浓度NO促进Nanog表达,维持多能基因Oct4和Sox2、抗凋亡基因Bcl2和Bc12lll及促凋亡基因Bac表达水平,下调促凋亡基因Bak1及Casp7基因表达水平。表明低浓度NO可以维持iPS细胞的多能性,并可以延缓在无LIF条件下iPS细胞的凋亡作用,维持其自我更新。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R329.2

【共引文献】
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