灰飞虱对吡虫啉抗性的生理生化及分子机制研究

【摘要】：灰飞虱Laodelphax striatellus (Fallen)属半翅目、飞虱科,主要分布于从菲律宾至西伯利亚一带的亚洲稻区和欧洲的温带地区。灰飞虱主要危害水稻,其次还有玉米和小麦,除以成虫、若虫刺吸危害外,还是传播多种植物病毒病的重要媒介。近年来,灰飞虱在江苏、浙江、安徽及山东等地区频繁暴发,给水稻的稳产、高产造成严重影响。目前,化学防治仍然是控制灰飞虱的主要措施,但是由于灰飞虱抗药性问题日益突出,使化学防治面临着一定的困难。因此,必须加强对灰飞虱的抗性治理,延缓其抗性的进一步发展,提高现有农药品种的防治效果。而明确杀虫剂的抗性机制是害虫抗性治理的前提。本文在室内筛选了灰飞虱对吡虫啉的抗、感品系；系统地研究了灰飞虱对吡虫啉的抗性生化和分子生物学机理,为更好地进行灰飞虱抗性治理提供科学依据。 一、灰飞虱抗吡虫啉品系的筛选及生化机理研究 以2010年采自江苏建湖的田间灰飞虱种群为起始种群,通过室内24代连续用吡虫啉进行抗性筛选和不接触药剂隔离饲养,分别获得了抗性为13.99倍的相对抗性品系JH-R和相对敏感品系JH-S。随后利用JH-S和JH-R品系的试虫,测定并比较了抗、感品系间多功能氧化酶(MFO)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和酯酶(Estersae)的酶活差异。结果显示：抗性品系的MFO活力是敏感品系的1.88倍,差异显著；GST活力在抗性和敏感品系间没有显著差异(0.96倍),而抗性品系的EST活力虽明显高于敏感品系(1.19倍),但统计上也没有差异。进一步的增效剂试验表明,三种增效剂在敏感品中对吡虫啉均没有显著的增效作用,增效比小于1.20。但在抗性品系中,除GST抑制剂DEM(1.11)外,MFO和酯酶的抑制剂PBO(1.70)和TPP(1.31)均有显著的增效作用。由此表明,在灰飞虱JH-R品系对吡虫啉的代谢抗性中,MFO解毒代谢能力的提高发挥了主要作用,EST的作用较小,GST可能在灰飞虱的吡虫啉抗性中没有明显的作用。 二、灰飞虱吡虫啉抗、感品系不同细胞色素P450基因表达量分析 利用已克隆验证的57条P450基因片段,设计特异引物,对灰飞虱抗、感品系试虫的P450基因表达量进行分析。通过半定量PCR发现,与敏感品系相比,CYP4Clv2、 CYP4C72、CYP6AY3v2和CYP353Dlv2四个基因在抗性品系中的表达量明显比在敏感品系中高。进一步利用实时定量PCR分析证实,CYP4C71v2、CYP4C72、CYP6AY3v2和CYP353Dlv2基因在吡虫啉抗性品系中表达量分别升高了1.67、7.96、8.94和1.82倍,统计差异显著,结果与半定量PCR一致。这些结果表明,过量表达的CYP4C71v2、CYP4C72、CYP6AY3v2和CYP353D1v2四个基因可能在吡虫啉抗性中发挥着重要的作用,半定量PCR是高通量筛选抗性相关代谢解毒酶基因的快速有效方法。 三、吡虫啉对灰飞虱不同细胞色素P450基因的诱导作用分析 以建湖敏感品系为材料,运用半定量PCR技术,对吡虫啉诱导前后的灰飞虱不同P450基因的表达量进行对比分析。结果发现用LD25剂量的吡虫啉诱导处理后4h,灰飞虱CYP4C71、CYP4C71v2和CYP439A1v3三个基因的相对表达量明显上调。进一步对HX、JH、JH-S和JH-R四个灰飞虱品系的上述三个基因进行定量分析,结果显示,CYP4C71、CYP4C71v2和CYP439A1v3三个基因在不同灰飞虱品系中均可被吡虫啉诱导,且在吡虫啉抗性灰飞虱品系中的诱导效应最明显。这表明,CYP4C71、 CYP4C71v2和CYP439A1v3三个基因可能参与了灰飞虱的吡虫啉解毒代谢过程。