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《南京农业大学》 2014年
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钙信号传导相关基因在小麦白粉病广谱抗性中的作用研究

李美娜  
【摘要】:由小麦白粉菌(Blumeria graminis f.sp tritici)引起的小麦白粉病是小麦主要的病害之一,随着小麦白粉病情的蔓延,培育和推广抗白粉病小麦品种显得越来越重要。但由于小麦基因组的庞大和复杂性,使得抗白粉病基因发掘、克隆和应用进展缓慢,其抗性分子机制的研究也相对滞后。在簇毛麦的6V染色体上携带广谱抗白粉病的基因Pm21,本实验室曹爱忠(2006)以白粉菌诱导前后的簇毛麦为材料,借助大麦基因芯片杂交技术获得了簇毛麦受白粉菌诱导前后的基因表达谱,筛选出一批簇毛麦中受白粉菌诱导上调表达的抗病相关基因。其中一类与钙离子信号传导途径相关的基因(MPK12、CaMBP4、CBL1、CPK12)在白粉菌诱导后的簇毛麦中显著上调表达,本研究结果表明该类基因参与了簇毛麦中由Pm21基因介导的广谱白粉病抗性。本文利用植物病理学和基因工程相关技术着重研究了这几个钙信号途径基因在小麦白粉病广谱抗性中的作用机制。1.钙离子信号途径参与了Pm2 基因介导的小麦抗白粉病反应本研究利用钙离子通道抑制剂LaC13处理高抗白粉病的南农9918(携带Pm21基因的小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系)的根部,并以水处理的感白粉病亲本扬麦158(不携带Pm21基因)和南农9918为对照,再接种小麦白粉菌并进行白粉菌发育进程的组织细胞学观察。结果表明,LaC13处理后的南农9918在白粉菌侵染的前期(接种后12h-72h)对白粉菌的抗性降低,而水处理的抗感对照的抗性水平没有显著改变,说明钙离子通道阻断后能使南农9918对白粉菌的抗性部分丧失。同时观察了上述材料白粉菌侵染后叶片表皮细胞的活性氧积累和过敏性坏死反应情况,发现钙离子通道阻断后南农9918叶片中的活性氧的积累量以及过敏性反应程度较水处理的对照均显著降低,这可能是导致其抗性部分丧失的原因,也说明钙离子信号途径与抗白粉病相关的活性氧和HR反应途径有着直接的关系。进一步对上述基因芯片筛选出的钙信号途径基因进行基因表达水平的分析,结果表明:在用LaC13阻断南农9918中的钙离子通道后,原本受白粉菌诱导上调表达的钙信号通路相关基因MPK12、CaMBP4、CBL1、CPK12均显著下调表达,说明这些基因均受白粉菌诱导激活的钙离子信号途径的调控。另外产生和清除活性氧的相关基因NADPH氧化酶基因、超氧化物歧化酶SOD基因及抗坏血酸过氧化物酶APX基因在LaCl3处理的南农9918叶片中受白粉菌诱导的表达情况也发生了显著的改变;同时参与SA通路的病程相关蛋白PRl、PR5、PR10原本在南农9918中受白粉菌诱导均显著上调表达,但在阻断钙离子通道的南农9918中受白粉菌诱导后表达量显著下降。根据以上结果表明,钙离子信号转导途径通过调控活性氧通路相关基因和SA通路病程相关蛋白的表达来参与由Pm21基因介导的小麦抗白粉病反应。2.MPK12、CaMBP4、CBL1、CPK12参与小麦抗白粉病反应的功能分析根据MPK12、CaMBP4、CBL1、CPK12在不同小麦抗感材料中受白粉菌诱导的表达模式以及基于VIGS的功能分析,本研究发现:MPK12、CaMBP4、CBL1、CPK12在携带Pm21基因高抗白粉病的南农9918中受白粉菌诱导均快速上调表达,在沉默了Hv-MPK12、Hv-CaMBP4、Hv-CBL1、Hv-CPK12 之后的南农9918 片中,白粉菌孢子较未接种病毒的南农9918对照相比可以正常发育,说明沉默这些基因能使南农9918的白粉病抗性降低,但并不能观察到叶片表面形成孢子堆,说明单独分别沉默这些基因不能使南农9918最终感病。因此这4个钙信号途径基因只参与调控了由Pm21基因介导的早期抗性反应过程。另外,在不合Pm21的感病品种扬麦158中、含有Pm4a基因的扬麦11中以及含有Pm6基因的IGVI465中,MPK12、CaMBP4、CBL1、CPK12也在白粉菌的诱导的后期(接种后48h)出现不同水平的上调表达,因此MP12、CaMBP4、CBL1、CPK12广泛并且不同程度地参与了由不同Pm基因介导的抗病反应。3.MPK12、CaaMBP4、CBL1、CPK12正向调控活性氧的积累在分别沉默了 MPK12、CaMBP4、CBL1、CPK12的南农9918中,活性氧通路的相关基因的表达也受到影响,参与活性氧生成的NADPH氧化酶表现出下调表达,而过氧化氢清除酶APX和CAT则呈现出上调表达的趋势,病程相关蛋白PR3和PR9表现出下调表达,这说明MPK12、CaMBP4、CBL1、CPK12可能正向调控活性氧通路的相关基因。此外,在用H202喷施处理的簇毛麦叶片后,Hv-MPK12、Hv-CaMBP4、Hv-CBL1、Hv-CPK12响应白粉菌的诱导快速且持续上调表达,并且表达水平显著高于水喷施处理后接菌的对照。而在用DMTU(过氧化氢清除剂)喷施处理的簇毛麦叶片后,Hv-MPK12、Hv-CaMBP4、Hv-CBL1、Hv-CPK12 对白粉菌未产生应答。说明活性氧通路的强激活又能正反馈调控Hv-MPK12、Hv-CaMBP4、Hv-CBL1、Hv-CPKL、的表达。4.转Hv-MPK12基因小麦植株的白粉病抗性有一定程度提高利用RT-PCR的方法从簇毛麦中克隆了其中的Hv-MPK12基因并将其转入感白粉病的扬麦158中,共获得180棵转基因植株,经PCR鉴定获得了 17个阳性T0代单株,接种白粉菌初步鉴定结果表明:17株阳性植株表现出不同程度的抗病表型,最高抗病指数达到0级免疫,1株出现过敏性坏死斑,8株表现4-5级(苗期9级鉴定标准)中感,说明过量表达Hv-MPK12后,扬麦158的抗性水平得到提高,但抗性是否能稳定遗传还有待利用高代株系进一步鉴定。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S435.121.46

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