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《南京农业大学》 2014年
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蓝莓花青素中锦葵色素对TNF-α诱导的血管内皮细胞炎症反应损伤的保护作用研究

王健  
【摘要】:研究背景心血管疾病是危害人类健康的头号杀手,而80-90%心血管疾病患者都伴随着高血压。“阻止高血压饮食计划(DASH)"中重要的一条就是增加水果蔬菜的摄入量。细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为重要的炎症因子,可以诱导内皮细胞表达相应蛋白,能显著增强血管内皮细胞单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和血管细胞间粘附分子-1(VCAM-1)蛋白和mRNA的表达,促进炎症发生及发展进程。蓝莓作为功能性食品,其果实中花青素的含量很高,具有抗炎症、增强心脏功能、改善血管循环、防止脑神经衰老、明目及抗癌等独特功效。研究发现蓝莓花青素中锦葵色素的含量很高,因此本文以氯化锦葵色素、氯化锦葵色素-3-葡萄糖苷及氯化锦葵色素-3-半乳糖苷为研究对象,研究它们对TNF-α诱导的体外人脐静脉内皮细胞炎症的保护作用及糖苷协同作用,并从分子基础上研究其作用机制,为心血管疾病的研究提供一定的理论基础。研究目的:1.体外分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC),采用TNF-α干预细胞,建立内皮细胞功能损伤所致的炎症模型,观察不同浓度氯化锦葵色素、氯化锦葵色素-3-葡萄糖苷及氯化锦葵色素-3-半乳糖苷对内皮细胞的保护作用。2.采用ELISA、Western Blot及RT-PCR方法检测不同锦葵色素对细胞中MCP-1、CAM-1及VCAM-1的表达情况,探讨它们保护HUVEC的分子机制。3.观察细胞中及细胞核中IκBα蛋白表达情况及NF-κB核转录情况,从分子基础上解释不同氯化锦葵色素对HUVEC炎症的保护作用及糖苷协同作用。研究方法:1.采用酶解法体外分离新鲜的婴儿脐带,得到人脐静脉内皮细胞,用M199完全培养基进行培养、传代及冻存;取3-6代人脐静脉肉皮细胞进行试验。2.采用不同浓度的肿瘤坏死因子TNF-α诱导HUVEC 4h及采用最佳浓度的TNF-α刺激细胞不同时间,取其细胞,分别采用ELISA检测细胞上清中MCP-1、 ICAM-1及VCAM-1蛋白表达水平;采用Western Blot检测细胞中ICAM-1及VCAM-1蛋白表达水平,根据分析结果确定TNF-α诱导HUVEC最佳剂量及时效。3.采用不同浓度的氯化锦葵色素、氯化锦葵色素-3-葡萄糖苷及氯化锦葵色素-3-半乳糖及选择最佳浓度的糖苷预处理细胞18h,加入10μg/L TNF-α刺激6 h,分别采用MTT法检测细胞活力;采用ELISA检测细胞上清中MCP-1及VCAM-1蛋白表达水平;采用Western Blot检测细胞中ICAM-1及VCAM-1蛋白表达水平,采用荧光定量RT-PCR检测细胞MCP-1及VCAM-1 mRNA的表达水平。4.采用最佳浓度的锦葵色素糖苷作用细胞,采用Western Blot检测细胞中IκBα蛋白表达变化,采用核转录-转运试剂盒检测细胞质中NF-κB核转录情况,从分子基础上研究抗炎症作用的机制。研究结果:1.TNF-α诱导HUVEC表达MCP-1α ICAM-1及VCAM-1蛋白正常细胞少量表达MCP-1αICAM-1及VCAM-1蛋白,在受到炎症因子TNF-α刺激时,各蛋白的表达量上升。不同浓度TNF-α刺激HUVEC得到细胞上清及细胞,通过ELISA及Western Blot检测MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白呈浓度依赖性变化,低浓度时蛋白表达量不显著,随着浓度增加,蛋白表达量增加,具有显著性,尤其在浓度为10斗g/L时,相比对照组MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白表达具有显著性意义(P0.01)。采用最佳浓度10μg/L TNF-α刺激细胞不同时间,表达量呈时间依赖性变化;短刺激时间对细胞中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白表达量影响较小,随着刺激时间的增加,表达量亦增长,尤其在刺激时间6h,细胞上清中可溶性MCP-1、 ICAM-1及VCAM-1蛋白表达量达到峰值,分别是对照组的3.762±0.041、8.436±0.367、8.554±0.069倍,具有显著性差异(P0.01)。细胞中ICAM-1/β-Actin及VCAM-1/β-Actin相对表达分别为对照组的2.268±0.012(P0.001)、1.616±0.022(P0.01)倍;在刺激时间为6h时,两者蛋白表达量达到峰值。2.氯化锦葵色素抑制TTNF-α诱导的HUVEC由MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白的表达MTT法检测细胞活力显示:当1、10、50、100 μmol/L Mv-Cl、Mv-3-glc-Cl及Mv-3-gal-Cl相比空白组的抑制率为92.6%、87.6%、70.1%、64.8%,92.6%、87.6%、70.1%、64.8%及86.3%、85.1%、70.3%、61.5%,与TNF-α共同作用时,,相比TNF-α刺激组具有显著性意义(P0.01),说明Mv-Cl、Mv-3-glc-Cl及Mv-3-gal-Cl不同程度的对内皮细胞具有一定的保护作用,由于浓度的增加,对细胞活力具有一定的影响。采用ELISA、Western Blot及RT-RCR检测细胞中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白及mRNA表达情况,正常情况下,正常细胞少量表达MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白及mRNA,当细胞受到炎症因子TNF-α刺激时,三种因子的表达量上升,当不同浓度Mv-Cl(1、10、50、100μmol/L)作用细胞时,蛋白及mRNA的表达量相比TNF-α刺激组具有显著下降,尤其是浓度为50、100 μmol/L时,三种因子的抑制率达到90%以上,接近于正常组,说明随着浓度的增加,Mv-Cl对TNF-α诱导的内皮细胞炎症具有保护作用.3.氯化锦葵色素-3-O-葡萄糖苷及半乳糖苷抑制TNF-α诱导的HUVEC中MCP-1、 ICAM-1及VCAM-1蛋白的表达通过ELISA、Western Blot及RT-PCR方法检测细胞中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白及mRNA变化,得出:不同浓度的Mv-3-glc-Cl、Mv-3-gal-Cl对TNF-α引起的炎症反应呈浓度依赖式保护作用。对于细胞中MCP-1及VCAM-1蛋白或mRNA, Mv-3-glc-Cl比Mv-3-gal-Cl抑制效果更明显,但在低浓度刺激时,对于细胞中ICAM-1, Mv-3-gal-Cl比Mv-3-glc-Cl作用效果明显,但随着浓度增加,葡萄糖苷式作用比半乳糖苷式发挥更强的保护作用。4.糖苷氯化锦葵色素协同抑制TNF-α诱导的HUVEC中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白的表达及分子机理研究通过ELISA法及Werstern Blot及RT-PCR检测发现预处理的Mv-3-glc-Cl、 Mv-3-gal-Cl和(Mv-3-glc-Cl+Mv-3-gal-Cl)对MCP-1、ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表达相比单独刺激TNF-α组具有明显的抑制作用,并且具有协同作用。通过Western Blot检测细胞质中IκBα蛋白得出,正常细胞受到TNF-α介导时,IκBα蛋白含量降低,验证了IκBα被降解,,从而表达MCP-1, ICAM-1和VCAM-1;而当孵育不同浓度氯化锦葵色素时,IKBα相对降解量相比TNF-α组减少。此外,通过免疫荧光检测NF-κBp65核转运情况也得到相应结果,正常细胞NF-κB捕捉的荧光强度很弱。单独TNF-α组NF-κB捕捉的荧光强度最强,随着Mv-3-glc-Cl、 Mv-3-gal-Cl和(Mv-3-glc-Cl+Mv-3-gal-Cl)的加入,NF-κB荧光强度相对于对照组渐渐变弱,证实了氯化锦葵色素能阻止NF-κB的激活,起到抑制炎症因子的作用,从而起到抗炎症的作用。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R54

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