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一株黑曲霉(Aspergillus niger Y9)的分离鉴定及其在修复重金属污染土壤上的作用

崔雨琪  
【摘要】:随着工农业的发展及城市化进程的推进,土壤重金属污染问题日趋严重。这不仅会造成农作物减产、农产品质量下降、地下水受到污染,而且会通过食物链富集到人体和动物体中,进而危及人类的生命和健康。近年来,国内外研究表明真菌产生的低分子量有机酸可以有效去除环境中的重金属。本研究从土壤中分离鉴定一株产酸黑曲霉,考察其生物沥浸去除土壤重金属的效果,研究了不同培养方法及不同泥浆浓度对土壤重金属浸出的影响,并考察了不同廉价碳源下黑曲霉纯培养及生物沥浸效果。主要研究结论如下:(1)自重金属污染土壤中分离出一株产柠檬酸、葡萄糖酸、草酸等小分子有机酸的真菌Y9,经形态学及ITS rDNA序列分析鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)。该菌适宜生长pH范围较广(3.0~8.0),对Zn2+. Cd2+. Pb2+的80%抑制浓度分别为250 mg/L.130 mg/L、2700 mg/L。在蔗糖培养基中纯培养20 d,pH降至2.1,柠檬酸、葡萄糖酸、草酸和苹果酸的产量分别为54.8 mmol/L.20.1 mmol/L.15.9 mmol/L和6.3 mmol/L。(2)利用A.niger Y9可有效浸出土壤重金属。接入1%的孢子悬浮液、纯培养2d后加入灭菌土壤使泥浆浓度为5%(w/v)的分步处理条件下,第15dZn、Cd、Pb的最高浸出率分别为75%、100%、43%;将等浓度的1%孢子液接入含固率为5%的灭菌土壤泥浆的同步培养条件下,Zn、Cd、Pb的最高浸出率出现在第12d,分别为64%、86%、19%。经黑曲霉沥浸处理后,生物有效性较强、危害较大的可交换态、碳酸盐结合态重金属溶解至液相,残留在土壤中的重金属总量大大降低,且大都以稳定的有机结合态和残余态存在,即有效降低了土壤重金属的毒性。综合考虑重金属浸出率和运行成本,黑曲霉同步培养处理更适宜该污染土壤的修复。(3)土壤泥浆浓度是影响黑曲霉生物沥浸效果的重要因素。沥浸体系的pH值随泥浆浓度的增大而升高,且泥浆浓度越大,葡萄糖酸产量越高,柠檬酸的产量越低,而草酸的产生出现延缓。随着泥浆浓度的增大,重金属浸出率呈递减趋势。泥浆浓度为5%(w/v)时浸出率最大(Zn84%、Cd95%、Pb40%),但当提高至10%(w/v)时,重金属浸出率为Zn71%、Cd94%、Pb32%。从操作成本角度考虑,10%(w/v)的泥浆浓度较为适用该区域污染土壤的黑曲霉生物沥浸处理。采用岭回归分析泥浆浓度和四种生物有机酸对重金属Zn、Cd、Pb浸出率的影响,结果表明:pH、泥浆浓度、柠檬酸含量是影响Zn浸出率的主要因素;草酸、pH和葡萄糖酸含量对Cd的浸出率影响较大;柠檬酸含量和pH对Pb的浸出影响最大。生物沥浸回流试验采用固液回流和液体回流两种方式。回流两次,二者均能有效溶出土壤中的Zn、Cd,但对Pb的浸出效果不佳,从处理效率上看,液体回流的效率更高。(4)采用5%(w/v)的蔗糖、甘蔗糖蜜、土豆皮、柑橘皮和玉米秸秆作为碳源培养黑曲霉。体系pH值从低到高排序为:蔗糖土豆皮玉米秸秆甘蔗糖蜜柑橘皮。HPLC结果显示该菌在各碳源培养基中产生的有机酸主要以草酸为主,伴随有少量的柠檬酸、葡萄糖酸和苹果酸,其中以玉米秸秆为碳源的纯培养体系草酸产量最高,达到了111 mmol/L。不同碳源条件下黑曲霉生物沥浸过程的pH值比纯培养体系略高,但整体变化趋势与纯培养基本保持一致,有机酸产量也以草酸为主,说明草酸在生物沥浸过程中是最主要的浸提剂。添加5%(w/v)的蔗糖、土豆皮或玉米秸秆作为碳源,A. nigerY9对于Zn的浸出效果较好,可达60-80%;Cd在蔗糖培养基中的浸出率最高,约为60%,其次是玉米秸秆沥浸体系,可达到43%;Pb在以玉米秸秆为碳源的培养基中浸出率最高(23%),而其他碳源条件下的Pb浸出率较低。甘蔗糖蜜和柑橘皮为碳源的沥浸体系由于pH较高产酸较少,重金属浸出率很低。本论文的研究结果对于黑曲霉生物沥浸技术在重金属污染土壤修复上的应用具有重要的指导意义。


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