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《南京农业大学》 2014年
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中药黄酮免疫增强剂藿蜂饮及作用机理研究

陈晓兰  
【摘要】:近年来,畜禽传染病等疫病的流行不仅使畜牧业遭受巨大冲击,而且危及到了公共卫生安全。这些危害大的疫病,绝大多数属于病毒性传染病,其中一些还属于免疫抑制性疾病。迄今为止,人们还没有找到有特效的治疗药物。除了加强饲养管理外,应用疫苗免疫是主要的预防措施,而应用免疫增强剂提高疫苗的免疫效果和增强动物的抗病能力是提高预防效果的重要措施。目前常用的免疫增强剂尚存在许多不尽人意之处,因此研制高效、低毒的新型免疫增强剂成为亟待解决的问题。研究表明,许多中药具有较好的免疫增强作用,中药免疫增强剂具有明显的优势。本研究在研制成功藿蜂注射液(EPI)的基础上,系统研究了其口服剂型藿蜂饮(EPO)的生产工艺、质量控制、稳定性、安全性、临床应用剂量、增强免疫的作用及机理。研究主要包括以下八个部分。试验Ⅰ、EPO生产工艺的研究在EPI制备工艺的基础上,研究了淫羊藿的提取、助溶剂的用量。淫羊藿提取试验,以淫羊藿多糖为指标,比较了加水倍数和煎煮温度对多糖含量的影响。结果表明,加20倍量水、100 ℃,煎煮时提取效率最好,多糖含量最高。助溶剂用量选择试验,比较了无水乙醇、大豆磷脂、吐温、聚乙二醇、丙三醇的用量对制剂性状和稳定性的影响,结果显示,无水乙醇、吐温、聚乙二醇、丙三醇体积比例分别为9.0%、2.0%、8.0%、6.0%,大豆磷脂质量比例为1.0%时效果最好。综合以上研究结果确定了EPO的生产工艺为:淫羊藿加20倍水量煎煮2次,第一次1.5 h,第二次1h,合并滤液,静置,离心去除沉淀,加蒸馏水至770 ml,滤过,滤液加丙三醇60ml,混匀;蜂胶加无水乙醇90ml溶解,加大豆磷脂10 g、聚乙二醇-400 80 ml,混匀,缓慢加入到淫羊藿溶液中,混匀,分装,灭菌。试验Ⅱ、EPO质量控制的研究研究了 EPO的检验方法。淫羊藿苷鉴别试验,比较了 3种取样量和3种点样量对淫羊藿苷薄层色谱的影响。结果显示,取样量为2.5 ml、点样量为3 μl时的薄层色谱最好。高良姜素鉴别试验,比较3种点样量对高良姜素薄层色谱的影响。结果显示,点样量为3 μl时的薄层色谱最好。淫羊藿苷含量测定试验,比较了两种流动相及不同洗脱方法对HPLC法中淫羊藿苷分离效果的影响,并进行了方法学验证。结果显示,以乙腈-0.15%磷酸(25:75),进行梯度洗脱,可快速、准确地测定EPO中淫羊藿苷的含量,方法的线性关系良好,精密度、回收率高,稳定性好,方法可行。白杨素和高良姜素的含量测定,建立了 HPLC含量测定方法,并进行了方法学验证。结果显示,两成分的峰形良好,未出现杂峰干扰或拖尾等现象;白杨素和高良姜素在150~750 ng范围内线性关系良好,精密度、回收率高,稳定好,方法可行。试验Ⅲ、EPO稳定性的测定测定了 EPO的稳定性,重点考察了性状、沉降体积比、pH值、再分散性、淫羊藿苷、高良姜素和白杨素的含量等项目。影响因素试验,考察了 45001x±5001x强光照射下三批EPO样品在D_0、D_5、D_(10)上述各指标的变化。结果显示,EPO在10 d内性状、沉降体积比和pH值保持稳定,再分散性良好,淫羊藿苷、白杨素和高良姜素含量稍下降,表明EPO对光照有一定的敏感性,宜避光保存。加速稳定性试验,在温度3℃±2℃、相对湿度为60%±5%的条件下三批EPO样品在第0、1、2、3和6个月各项指标的变化。结果表明,EPO在6个月内稳定。长期稳定性试验,考察了在室温条件下三批EPO样品在0、3、6、9和12个月各项指标的变化。结果表明,EPO在12个月内稳定。试验Ⅳ、EPO的安全性测定测定了 EPO的安全性。急性毒性试验,在预试验证明无法测得LD50的基础上,测得EPO的最大给药量为32 g/kg,表明EPO实际无毒。长期毒性试验,取ICR小鼠100只随机均分为5组,3个给药组分别灌胃40mg/ml、10 mg/ml和2.5 mg/ml的EPO 0.4 ml,溶剂对照组(SC)灌胃EPO溶剂0.4 ml,空白对照组(BC)灌胃等体积的生理盐水,每天1次,连续14 d。于给药前(D0)、停药后D_1、D7和D_14称重,计算平均体重;于D_1和D_14抽样,采血测定血常规、血清生化指标和脏器指数,剖检,取肝、肾切片观察病理变化。结果显示,给药后各组小鼠的临床体征正常,各给药组和SC组在停药后D_1和D_14血常规、血清生化指标均在正常范围,剖检及肝肾切片未见明显病理变化。表明无明显的长期毒性。靶动物鸡安全性试验,取14日龄健康罗曼雏鸡80只,随机均分为4组。三个给药组分别饮服1.25 mg/ml、0.75 mg/ml、0.25 mg/ml 浓度 EPO 1ml/只,每天 1 次,连续 9 d,空 白对照组不给药。每天观察鸡的给药反应,连续观察至停药后D7。分别于给药前当天(D0)、停药后D_1、D7称重,计算平均体重。于D_1每组随机抽取4只鸡,采血测定血常规和血清ALT、ALP、CREA和BUN的含量。结果显示,EPO各给药组鸡临床体征正常,各项指标与对照组比较均无显著差异。结果表明EPO对靶动物鸡安全。试验Ⅴ、EPO剂量筛选试验14日龄雏鸡300羽随机均分为10组,每组30只。除空白对照组(BC)外均用NDV-IV疫苗滴鼻点眼免疫,1头份/羽,28日龄二免。在每次免疫的同时,EPO的7个剂量组分别灌服浓度为0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75 mg/ml的EPO 1ml,每天1次,连用3d;EPI对照组在首次免疫的同时一次肌注EPI 0.5 ml;免疫对照组(VC)和空白对照组(BC)不给药。分别于首免后D7、D_14、D21、D28每组随机抽取6只鸡翼静脉采血,用血凝抑制试验检测血清新城疫抗体效价,并称重,计算增重率。结果显示,所有鸡精神、饮食等均正常。0.25 mg/羽组在所有时间点的抗体效价最高,显著高于VC组,增重率显著高于VC组和BC组、在后两个时间点多显著高于其它给药组。结果表明,EPO在合适的剂量能显著增强体液免疫应答,促进雏鸡生长,0.25 mg/羽的剂量最好,与EPI的效果相似。试验Ⅵ、EPO增强鸡新城疫疫苗免疫效果的测定14日龄雏鸡320羽随机均分为8组,除空白对照组外均用NDV-Ⅳ系疫苗免疫,28日龄二免。在每次免疫的同时,EPO的高、中、低剂量组每分别饮服EPO 0.125、0.25、0.5 mg,组分药对照组分别饮服EP和PF 0.25 mg,每天1次,连用3 d;EPI对照组一次肌肉注射0.5 ml;免疫对照组和空白对照组不给药。测定免疫后D7、D_14、D21、D28和D35血清抗体效价、淋巴细胞增殖、血清IL-2和IFN-γ含量以及免疫器官指数的变化。结果显示,EPO高、中剂量组在所有时间点的抗体效价、在D_14~D35的淋巴细胞值及大多数时间点的IFN-γ和IL-2含量显著高于免疫对照组及组分药对照组,稍优于EPI组,免疫器官指数在所有时间点也有所提高。结果表明,EPO能显著提高机体的系统免疫应答,高、中剂量的效果较好。试验Ⅶ、EPO增强鸡小肠黏膜免疫功能的测定14日龄雏鸡320羽随机均分为8组,除空白对照组外均用NDV-Ⅳ系疫苗免疫,28日龄二免。在每次免疫的同时,EPO的高、中、低剂量组每分别饮服EPO 0.125、0.25、0.5 mg,组分药对照组分别饮服EP和PF 0.25 mg,每天1次,连用3 d;EPI对照组一次肌肉注射0.5 ml;免疫对照组和空白对照组不给药。分别于首免后D7、D21、D35,每组随机抽取6只鸡测定十二指肠和空肠洗液中sIgA和IL-17含量、十二指肠黏膜上皮淋巴细胞数、空肠黏膜和盲肠扁桃体IgA+细胞数。结果显示,在首免后各时间点,EPO高、中剂量组十二指肠和空肠洗液sIgA及IL-17的含量、十二指肠上皮内淋巴细胞数量及空肠和盲肠扁桃体IgA+细胞数量均显著大于免疫对照组,多大于或显著大于EPI、EP和PF组。结果表明,EPO能显著增强小肠的黏膜免疫功能;高、中剂量的效果最好,稍优于EPI。试验Ⅷ、EPO拮抗免疫抑制的作用测定11日龄健康罗曼鸡300只随机均分为6组,除空白对照组(BC)外每羽肌肉注射8 mg/ml的环磷酰胺溶液0.5 ml,每天1次,连续3 d;14日龄时,EPO的高、中、低剂量组分别每羽饮服0.5、0.25、0.125 mgEPO,EPI注射液对照组肌注EPI 0.5 ml,每天1次,连用3 d,模型对照(MC)组和BC组不给药。分别于给药后D7、D_14、D21、D28每组随机抽取4羽心脏采血,用MTT法测定外周血T淋巴细胞增殖;同时每组随机抽取6羽,称重,计算平均体重,分离脾脏、法氏囊和胸腺,称重,计算免疫器官指数。结果显示,EPO高、中剂量组淋巴细胞增值率、脏器指数、平均体重在大部分时间点均显著高于MC组。结果表明,EPO能显著拮抗环磷酰胺诱导的雏鸡免疫抑制,促进雏鸡生长。高、中剂量的效果最好,与EPI的效果相当。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S853.7

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