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《南京农业大学》 2014年
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萝卜铅(Pb)胁迫响应的分子机制研究

王燕  
【摘要】:重金属污染严重影响蔬菜作物产量与品质,通过食物链会严重威胁人类健康。铅(Pb)是最有毒的重金属之一,容易被植物所吸收、并在不同的部位积累。萝卜(Raphanus sativus L.)是一种主要以膨大的肉质根为食用器官的蔬菜作物,其肉质根容易受到Pb等重金属的影响,因此研究萝卜对重金属的胁迫响应机制和遗传调控网络显得极为重要。前人在萝卜Pb吸收累积、转运和胁迫响应生理生化变化等方面已进行相关研究,但对萝卜Pb胁迫响应的分子机制尚不清楚。鉴定出萝卜Pb胁迫响应的功能基因、蛋白或代谢物是阐明其胁迫响应分子机制的重要基础。本研究以萝卜高代自交系'NAU-RG'为试材,采用基于新一代测序技术的RNA测序(RNA-seq)对萝卜肉质根进行转录组de novo测序,并且从转录组、蛋白组与代谢组水平等方面系统研究萝卜重金属Pb胁迫响应的分子机制。主要研究结果如下:1.为了获得较为全面的萝卜肉质根转录组数据,利用Solexa Illumina平台对不同发育阶段(包括幼苗期、破肚期和成熟期)的肉质根进行混样,构建了一个cDNA文库(‘CKA’)进行双末端测序。共获得约66.11M clean reads数据,通过拼接得到73,084条unigenes,其中N50为1,095 bp,总长度为55.73 Mb。对所得到的unigenes与NCBI non-redundant (NR)-. Gene Ontology (GO)、Clusters of Orthologous Group (COG)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)等公共蛋白数据库进行相似性比对,共有67,305条unigenes(占总数92.09%)得到了功能注释。这些unigenes主要参与基本生理和代谢过程,次生代谢物的生物合成途径、信号转导和其它一些与细胞成分、分子功能相关的过程。所获得的转录组数据为研究萝卜肉质根中相关性状形成的分子机理和特定响应过程中关键基因分离鉴定提供了重要信息基础。2.为了在mRNA水平上分离鉴定Pb胁迫响应网络中差异表达基因,通过构建对照组(CK)和处理组(Pb1000)萝卜肉质根RNA文库,利用高通量测序技术进行了萝卜Pb胁迫响应的差异基因表达谱分析。共获得4,614个显著的差异表达基因(DEGs),包括2,154个上调表达和2,460个下调表达基因。GO和pathway富集分析表明,Pb胁迫上调表达的差异基因主要参与细胞壁的防御响应、谷胱甘肽代谢相关的生化过程,而下调表达的差异基因则主要参与碳水化合物代谢相关途径。利用qRT-PCR技术对22个差异基因进行表达模式验证,发现与RNA-seq分析结果高度一致。此外,成功鉴定出多个参与防御和解毒机制的候选基因,包括编码信号感知转导蛋白激酶、转录因子、金属转运蛋白及合成螯合物相关酶的基因。3.为系统分离鉴定萝卜肉质根中Pb胁迫响应的miRNA及其靶基因,构建了对照组(CK)和处理组(Pb500)萝卜肉质根sRNA文库。通过应用Solexa测序共鉴定到74个已知miRNA和173个新型miRNA.其中,有25个已知的和9个新型miRNA被鉴定为Pb胁迫响应miRNA.基于萝卜参考基因组序列的降解组分析,共得到1,979个]miRNA-mRNA靶向转录本。GO分析表明,这些靶向转录本主要参与转录调控、防御响应和与结合有关的过程。同时鉴定的Pb胁迫响应miRNA的靶基因主要参与逆境相关的信号感知、转导和相关次级代谢途径,及与金属离子吸收和体内转运机制,包括激活多种金属转运蛋白和调节相关的转录因子。4.运用蛋白组学iTRAQ技术对Pb500和Pb1000胁迫下萝卜肉质根蛋白质组变化进行分析。在95%的置信区间内共鉴定到3,898个蛋白,对2,141个蛋白进行定量分析。2种Pb处理的差异蛋白有部分重叠,共有721个蛋白在至少一种Pb胁迫处理中差异表达,135个蛋白在Pb500与Pb1000处理下均显示差异表达。GO和pathway富集分析表明,135个共同差异表达蛋白主要参与细胞结构组分变化、碳水化合物和能量代谢相关的代谢途径和抗氧化防御。此外,将萝卜Pb胁迫下蛋白水平与转录水平的相关数据进行关联分析,有77.3%可鉴定蛋白和和77.9%的可定量蛋白在转录水平被关联到,但其表达丰度变化却呈现出极低的相关性。5.应用GC-MS技术对Pb胁迫下萝卜肉质根的代谢物组分进行分析。对照组(CK)和处理组(Pb1000)在主成分分析(PCA)和偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)中均可明显区分,采用PLS-DA模型第一主成分的VIP (Variable Importance in the Projection)值(阈值1),并结合学生氏t检验(t-test)(阈值0.05),参照NIST数据库(比较质谱和色谱保留时间)共鉴定出28个代谢物在Pb胁迫处理下具有显著差异性,这些代谢物主要集中于糖类、氨基酸和有机酸。此外,将代谢组分析数据与转录组相关数据进行整合,KEGG pathway分析表明,萝卜Pb胁迫下可影响碳水化合物、能量代谢和谷胱甘肽代谢等相关生化网络。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S631.1

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