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《南京农业大学》 2012年
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玉米ZmCPK11在ABA诱导的抗氧化防护中的功能分析

丁艳芬  
【摘要】:脱落酸(abscisic acid, ABA)是一种重要的植物激素,在植物生长发育中以及植物应对各种环境胁迫反应中起重要作用。钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPKs),是在植物中首先发现的一种钙依赖型蛋白激酶,可以直接被钙离子信号激活,在植物生长发育和适应逆境过程中起重要的调节作用。越来越多的证据表明,在植物碳氮代谢、离子和水分跨膜运输、细胞骨架调节、气孔运动调节、生长发育调节以及生物、非生物胁迫应答反应中均有CDPKs的参与。本实验研究参与ABA信号途径的玉米CDPK。首先运用生物信息学和RT-PCR技术在玉米幼苗叶片中克隆出一个钙依赖蛋白激酶:ZmCPK11。氨基酸序列比较显示与AtCPK4, AtCPK6, AtCPK11同源性较高,均不低于60%。生物信息学分析结果表明,ZmCPK11编码产物为511个氨基酸,分子量为56.21kD,等电点为4.97。对ZmCPK11编码蛋白的结构功能域分析发现,与典型CDPK蛋白激酶一样,ZmCPK11也含有1个蛋白激酶结合区和4个EF手型结构钙结合区。运用半定量实验证明ZmCPK11基因受ABA与H202诱导。亚细胞定位实验表明ZmCPK11定位于细胞核与细胞质中。运用半定量和定量RT-PCR的方法确定了10 mM H2O2、100 μM ABA、10mM CaCl2、10% PEG (PEG 6000)均可诱导玉米中的ZmCPKll基因上调。ABA和H202处理后,玉米叶片中ZmCPK11基因转录水平与对照组相比,出现快速、瞬时的上调。Western-blot实验表明,10 mM H2O2、100 μM ABA、10mM CaCl2均诱导ZmCPK11蛋白水平的持续时间较长的上调。免疫共沉淀激酶活性反应表明ZmCPK11活性也被10mMH2O2、100μM ABA、10mM CaCl2激活。并且CaCl2诱导较早,H202与ABA诱导随后。抑制剂实验表明:ABA合成抑制剂fluridone干扰了PEG对ZmCPK11基因表达的诱导,再外源施加ABA又能诱导ZmCPK11基因表达上调。H2O2清除剂DMTU、CAT, NADPH氧化酶抑制剂DPI处理后,降低了ABA对ZmCPK11基因和ZmCPK11活性的诱导。与本实验室之前的研究:信号转导的方向是从PEG到ABA再到H202的结果一致。为了进一步研究ZmCPK11的功能,构建了ZmCPK11基因的过表达载体。运用原生质体瞬时表达体系,发现过表达ZmCPK11基因可以明显提高SOD和APX酶的活性。而沉默了ZmCPK11基因,SOD和APX的活性显著下降。经ABA处理后,SOD和APX的活性略有上升,实验结果表明ZmCPK11参与了ABA诱导的抗氧化防护,在其中发挥重要作用,对植物增强抗氧化防护,提高抵御非生物胁迫的能力有重要意义。本文试图探讨ZmCPK11与ZmMPK5在ABA信号通路中的关系。首先进行的抑制剂试验表明:CDPK抑制剂TFP,钙离子螯合剂EGTA处理后,ABA诱导的ZmMPK5基因表达和ZmMPK5活性与对照相比均无明显上调;而MAPKK抑制剂PD98059,U0126处理后,ZmCPK11基因表达和ZmCPK11活性与对照相比没有明显变化。原生质体基因沉默实验显示:沉默ZmCPK11可以抑制ZmMPK5基因表达和ZmMPK5活性的诱导;而沉默ZmN MPK5对ABA诱导的ZmCPK11基因表达和ZmCPK11活性没有显著影响。在原生质体中过表达ZmCPK11和ZmMPK5都可以诱导抗氧化防护酶的活性上升,沉默2mMPK5阻止了过表达ZmCPK11引起的下游抗氧化防护反应,显示出ZmCPK11在ZmMPK5的上游。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:Q943.2

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