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《南京农业大学》 2015年
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猪Mx1蛋白体内抗猪瘟病毒研究及其突变体活性分析

张小敏  
【摘要】:Mx(Myxovirus resistance)是一种由Ⅰ/Ⅲ干扰素(IFN)诱导的存在于所有脊椎动物中具有GTP酶活性的抗病毒蛋白。猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种具有高度接触性传染病,给全球养猪业带来严重的经济损失。作为Mx蛋白家族的一员,我们先前的研究结果表明猪Mx1蛋白对水疤性口炎病毒有强大的抗病毒能力,稳定表达融合蛋白EGFP-poMx1的PK-15细胞系能抑制猪瘟病毒入胞后在细胞内的复制,降低子代病毒数量。本文验证了猪Mx1蛋白对VSV复制的抑制作用,使用了ST和3D4/21两个猪源细胞系,进一步调查了 PTD-poMx1在体外针对CSFV的抗病毒活性,并以猪为实验对象研究了 PTD-poMx1在体内抗CSFV活性。通过构建一系列Mx1蛋白突变体发现其GTP酶活性和寡聚不是猪Mx1抑制猪瘟病毒增殖的必需条件。1.融合HIV蛋白转导域(PTD)的猪Mx1蛋白对水疱性口炎病毒的抑制研究我们应用pColdI系统表达了融合HIV-1的N末端Tat蛋白转导结构域(PTD)的猪全长Mx1蛋白(PTD-poMx1),并在Vero细胞中研究了对水疱性口炎病毒(VSV)复制的影响。结果表明,纯化的PTD-poMx1融合蛋白可以在孵育5h后入胞且无细胞毒性。此外,通过空斑减少实验、TCID50、实时荧光定量RT-PCR和Western blot确定了纯化的融合蛋白在VSV感染的Vero细胞中的抗病毒活性。这些数据表明PTD-poMx1融合蛋白可能作为一种新型的抗病毒试剂来抑制VSV的感染。2.融合HIV蛋白转导域(PTD)的猪Mx1在体外和体内抑制猪瘟病毒的感染研究本研究使用ST和3D4/21两个猪源细胞系,进一步调查了 PTD-poMx1在体外针对CSFV的抗病毒活性。结果表明,PTD-poMx1在3h内转导进两个细胞系,且没有影响猪瘟病毒的入胞和摄取,并在细胞中能维持20h。qRT-PCR数据及病毒滴度表明PTD-poMx1在两个细胞系中能有效抑制CSFV的复制。应用剂量为1mg的PTD-poMx1耳静脉注入105 TCID50的CSFV感染猪的体内结果显示,PTD-poMx1能减轻CSFV感染猪的临床表现和病毒血症,并呈现剂量依赖性。但是我们也发现PTD-poMx1不能完全阻止病毒在体内的复制,这表明PTD-poMx1对于猪瘟的致命性提供了部分的保护。3.GTP酶活性和寡聚不是猪Mx1抑制猪瘟病毒增殖的必需条件我们构建了猪Mx1蛋白的GTP酶缺失突变体(K83A,T103A和L612K)和未缺失突变体(E646R),并在PK-15细胞上研究了对CSFV复制的影响,同时设野生型Mx1(WT)及空载(GFP)作为对照,首先激光共聚焦观察了各个突变体形态。结果表明,仅L612K呈单体形态,其他突变体呈不同程度的寡聚,且所有蛋白均位于宿主细胞内质网上。此外,通过荧光定量RT-PCR、TCID50测定发现,只有L612K与WT具有抗CSFV复制的能力。同时,研究发现显性负突变体T103A与WT寡聚能干扰WT抗病毒活性。总之,这些数据表明,GTP酶活性和寡聚不是猪Mx1抑制猪瘟病毒增殖的必需条件。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S852.65

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