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基于高密度SNP芯片的大豆籽粒异黄酮含量的全基因组关联分析

褚姗姗  
【摘要】:异黄酮是高等植物的次级代谢产物,在食品、医药、美容、动物养殖业和农业中都有巨大的应用价值。国际市场对异黄酮的需求正在逐年增加。由于大豆[Glycine Max(L.)Merr.]是异黄酮的主要来源,因此培育高异黄酮含量的专用型品种是大豆品质育种的主要目标之一。然而大豆异黄酮属于多基因调控的复杂数量性状,极易受到环境因素的影响,基于表型选择的传统育种方式很难取得突破性进展。高通量分子标记分型技术的出现及其在植物育种中的应用,为我们了解调控大豆异黄酮合成的分子遗传机制提供了重要手段,同时为从分子水平改良大豆异黄酮含量提供了重要的技术条件。为了探究大豆籽粒异黄酮生物合成的遗传基础,本研究设计并开发了一款覆盖大豆全基因组的高密度SNP芯片NJAU 355K SoySNP,并对367份大豆材料进行SNP基因分型,通过利用其中196份栽培大豆的SNP分型数据进行全基因组关联的方法在一年两点的环境下鉴定了与大豆籽粒异黄酮含量相关的SNPs位点,并进行了候选基因预测与初步功能研究,主要结果如下:1.本研究设计的高密度SNP芯片NJAU 355K SoySNP包含355595个SNPs位点,覆盖了大豆整个基因组。该芯片在367份大豆材料(包括105份野生大豆和262份栽培大豆)的SNP分型检测结果表明经SNP质控过滤后的292053个SNP标记在染色体上的分布并不均匀,39.47%的SNP定位于着丝粒区域,60.53%的SNPs定位于染色体臂区域。在这些SNPs中291962个SNP能够定位于染色体上,91个SNP定位在非锚定的序列片段上。其中定位在染色体上的SNP标记在大豆基因组中(975Mb)的平均SNP间距约为3.3kb,并且95.2%的SNP标记的间距在9kb以内,只有66个SNP标记间距在100kb以上。在291962个定位于染色体上的SNPs中,30.86%的SNP标记位于基因区域内。我们鉴定了 13444个非同义替代SNPs分布在11407个基因中,其中994个非同义替代SNPs导致了 977个基因的起始密码子变异、提前终止或延长转录。高质量的SNP标记覆盖了大豆基因组的37370个基因,占大豆总基因数的68.98%。此外有215657个SNPs的最小等位基因频率(MAF)大于10%。根据基因分型结果进行了群体遗传学分析,结果表明栽培大豆很可能起源于中国北部和中部区域,随后扩散至全国其它区域。人工选择信号的全基因组扫描分析检测到了 1128个基因分布在具有选择清除信号的区域中,并且这些基因主要与重要的驯化农艺性状相关。2.利用本研究开发的高密度SNP芯片在其中196份栽培大豆中的SNP分型数据,我们对大豆籽粒异黄酮含量性状进行了全基因组关联分析,结果显示:在本研究的自然群体中的异黄酮含量存在广泛的表型变异。其中黄豆苷类含量的最大变幅达173倍。虽然基因型效应、环境效应以及基因型和环境的互作效应均显著地影响异黄酮及其各组分的含量(P0.001),但总异黄酮含量、大豆苷类含量、黄豆苷类含量和染料木苷类含量遗传率均比较高67.8%-83.8%,说明群体中异黄酮含量的大部分表型变异主要来源于遗传因素。大豆籽粒异黄酮总含量及其三个主要成分之间的相关性分析表明,除了染料木苷类含量与黄豆苷类含量之间的相关性不显著之外,其他各组分间含量均呈极显著正相关。利用压缩混合线性模型(cMLM)的全基因组关联分析检测到43个显著关联的SNPs,共涉及到33个SNPs。南京点的表型关联到40个显著的SNPs,显著多于南通点的表型关联到的3个SNPs,而且两个地点环境的显著SNPs位点并不重合。这些SNPs位点分布在第5号、6号、11号和20号染色体上,并在11号和20号染色体上呈现成簇分布现象。检测到15个SNPs与异黄酮总含量显著关联,10个SNPs与大豆苷类含量显著关联,18个SNPs与黄豆苷类含量显著关联。其中与大豆苷类含量显著关联的10个SNPs与异黄酮总含量共关联。遗憾的是没有检测到与染料木苷类含量显著关联的SNPs位点。检测到的显著关联的SNPs位点的表型变异解释率的范围为10.54%-14.53%。对所关联到的SNPs衰减距离内的基因进行注释发现不存在已鉴定的异黄酮合成途径的结构基因,但存在许多不同类型的转录因子基因。仅存在一个显著关联的SNP位于基因区间内,该SNP与异黄酮总含量和大豆苷类含量共关联,位于GmMYB29转录因子基因的5'非翻译区,该基因与百脉根中鉴定的一个调控异黄酮合成的转录因子基因直系同源,暗示这个基因可能参与大豆异黄酮生物合成途径的调控。3.对GmMYB29转录因子基因的初步功能研究结果表明该基因定位于细胞核。在谷胱甘肽(GSH)和斜纹夜蛾虫诱导处理的叶片中,GmMYB29和异黄酮合成关键酶基因IFS2的诱导表达模式一致。在大豆不同的组织中,异黄酮类化合物的积累与GmMYB29和IFS2基因的表达密切相关。双荧光素酶报告系统的瞬时表达分析结果表明GmMYB29能够显著促进IFS2和CHS8启动子表达活性提高。IFS2的启动子系列片段截短分析表明IFS2启动子的-885和-1093之间的208bp区域包含启动子激活的必须元件,对该区域的顺式作用元件预测发现仅存在一个MYB结合元件MYBCORE,暗示着GmMYB29很可能是通过识别此顺式作用元件从而结合IFS2的启动子并驱动其表达。为了进一步验证GmMYB29在异黄酮合成中的作用,我们分别构建了GmMYB29的过表达载体和以GmMYB29为靶标的RNAi载体转化大豆毛状根。在过表达GmMYB29和沉默GmMYB29的转化毛状根中检测到总异黄酮的含量分别呈现升高和降低,虽然与对照相比异黄酮含量的变化不超过3.3倍,但均已达到显著水平,提供了它在调控异黄酮合成中的直接证据。


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