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《南京农业大学》 2015年
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稻瘟病菌MoSFA1和MoHB1基因鉴定与功能分析

张震  
【摘要】:由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻生产中最为严重的病害之一,稻瘟病的可持续性控制仍是水稻生产中亟待解决的重要难题之一。开展稻瘟病菌基因功能的研究,有利于更好的了解其生物学特性,从而有利于提出稻瘟病针对性的防控措施。另一方面,由于稻瘟病菌培养和遗传操作的简易性,以及基因组测序的完成,稻瘟病菌业已成为丝状真菌分子生物学和侵染机制研究的重要模式物种,而其与水稻的互作研究也是植物病原真菌与寄主互作机制研究的模式之一。一氧化氮(Nitric oxide,NO)在生物体同时具有毒性和保护作用。NO作为一个重要的信号分子在诸多生物学过程中发挥着重要作用,另一方面过量的NO可使细胞受到亚硝化胁迫而引起毒害。植物与病原真菌互作中,病原菌的PAMPs(Pathogen-Associated Molecular Patterns)和效应子可以诱导寄主细胞NO的迸发,激活一系列的抗病反应。植物源NO的迸发同时也为寄主营造一个抗微生物的环境,直接或间接阻碍病害菌的侵染。另一方面,植物病原菌也能合成内源NO,它参与真菌的产孢、侵染结构的分化和致病性等生物学过程。因此,维持细胞内NO代谢平衡,对于实现病原菌正常的生理和生物学功能具有重要意义。微生物已经进化有回避NO胁迫的机制,其中亚硝基谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reductase,GSNOR)和黄素血红蛋白(Flavohemoglobin)可以通过间接或直接代谢NO成无毒分子来保护自身不受到NO的毒害。生物体中,S-(羟甲基)谷胱甘肽脱氢酶(EC 1.1.1.284)具有GSNOR活性,它可以特异性的将GSH和NO的自然反应产物S-亚硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione,GSNO)还原成NH3和谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。S-(羟甲基)谷胱甘肽脱氢酶属于Ⅲ类酒精脱氢酶,也参与谷胱甘肽依赖的甲醛脱毒。这个酶在生物体中普遍存,且高度保守。在酿酒酵母中,S-(羟甲基)谷胱甘肽脱氢酶编码基因SFA1缺失,导致突变体为对NO胁迫的超敏感性和胞内亚硝基硫醇(S-nitrosothiols,SNOs)的异常积累。黄素血红蛋白是微生物中普遍存在的一种球蛋白,它在有氧条件下可以将NO氧化成无毒的NO3-,在无氧条件下亦可将NO转化为无毒的N2O。微生物黄素血红蛋白基因的缺失往往导致突变体对NO胁迫超敏感,其生长受到抑制,而且也可引起病原菌致病性的减弱甚至丧失。稻瘟病菌与水稻互作时,一方面水稻细胞受稻瘟病菌效应子的激发能产生NO;另一方面稻瘟病菌合成的内源NO在调控病菌发育和侵染早期过程中发挥着重要作用。由此推测,不管是稻瘟病菌自身发育还是与寄主互作时,维持稻瘟病菌细胞内NO代谢平衡对于NO行使正常的生理和生物学功能具有重要的意义。因此,本文对稻瘟病菌中NO降解相关基因亚硝基谷胱甘肽还原酶和黄素血红蛋白编码基因开展了功能研究,结果如下:根据酿酒酵母SEA1编码蛋白序列在稻瘟病菌基因组数据库中检索到与其高度同源的基因MGG_06011。MGG_06011编码蛋白包含所有已知与维持S-(羟甲基)谷胱甘肽脱氢酶的结构和功能相关的保守位点。用MGG_06011基因互补酿酒酵母突变体Δsfa1,能够恢复Δsfa1在甲醛培养基上的生长缺陷和对GSNO的完全还原能力,表明了MGG_06011与酵母SFA1功能同源。由此,我们认为MGG_06011是稻瘟病菌S-(羟甲基)谷胱甘肽脱氢酶编码基因,且其同时具有甲醛脱毒和GSNO还原活性,命名为MoSFA1。利用GFP基因融合表达,结果表明MoSFA1蛋白分布于稻瘟病菌细胞质中;MoSFA1基因表达分析显示,在孢子萌发、附着胞形成和与植物互作中MoSFA1基因表达随着发育状态受到调控。我们构建了MoSFA1基因缺失突变体和互补子,并对它们的表型进行了分析。结果显示,MoSFA1基因缺失导致突变体在包含有甲醛的CM平板上不能生长,且突变体生长被NO供体SNP所抑制。突变体细胞内SNOs异常积累,且SNOs积累受到外源NO诱导。MoSFA1基因缺失导致突变体在CM平板生长减慢、菌丝黑色素化程度下降、分生孢子产量显著降低。MoSFA1基因缺失突变体对水稻致病性下降,但不影响对受伤叶片的致病力。我们由此推测,MoSFA1基因在稻瘟病菌致病过程中至少参与调控侵入和活体寄生,但对死体寄生无影响。MoSFA1基因缺失突变体分生孢子萌发和附着胞形成均正常,但突变体附着胞膨压降低导致侵染率下降、侵染菌丝的生长也受到抑制。MoSFA1缺失突变体侵染的寄主细胞内H202异常积累。而MoSFA1基因缺失导致突变体对氧化剂超敏感,突变体抗氧化酶SOD和POD酶活性下降,胞内还原型GSH含量下降。但是MoSFA1基因缺失突变体挑战接种不影响水稻PR基因的表达,说明MoSFA1基因缺失导致的致病性的下降与亲和寄主PR基因介导的防卫反应无关。由此,表明MoSFA1基因参与调控稻瘟病菌抗氧化系统,MoSFA1基因在稻瘟病菌与寄主互作中参与调控寄主活性氧的清除。此外,MoSFA1基因缺失影响突变体对硝酸盐和亚硝酸盐的利用,但突变体中NR和NiR基因却均被极显著上调表达。推测MoSFA1参与调控的蛋白质S-亚硝基化修饰有关,氮素利用相关蛋白被异常修饰可能导致构象或活性的改变,但仍需要后续研究证实。在稻瘟病菌基因组数据库中检索到与酿酒酵母黄素血红蛋白编码基因YHB1高度同源的基因MGG_00198。MGG_00198编码蛋白包含已知维持黄素血红蛋白结构和功能所必需的相应保守位点。MGG_00198基因互补酵母突变体△yhb1,能够恢复△yhb1在含GSNO培养基中的生长缺陷,表明了MGG_00198与YHB1功能同源。MGG_00198基因编码稻瘟病菌黄素血红蛋白,命名为MoHB1。基因表达分析显示,在孢子萌发和附着胞形成过程中MoHB1基因表达受发育状态的调控。基因受外源NO处理被迅速诱导表达,且表达水平具有剂量效应。我们构建了MoHB1基因缺失突变体和互补子,并对它们的表型进行了分析。结果显示,MoHB1基因缺失导致突变体对外源NO和H202胁迫超敏感,在含有不同NO供体和H202培养基上的生长与野生型比较受到显著抑制。与MoSFA1基因缺失突变体比较,外源NO对MoHB1基因缺失突变体的生长抑制显著大于前者,而氧化剂对MoHB1基因缺失突变体的生长抑制则正好相反。但是,MoHB1基因缺失并不影响突变体正常的营养生长、产孢和致病性。MoHB1缺失导致突变体中MoSFA1基因在分生孢子萌发和附着胞形成过程中表达水平进一步增强,表明MoHB1和MoSFA1在功能上可能存在部分互补;MoHB1和MoSFA1基因基因双缺失突变体,进一步增加了对NO胁迫和氧化剂的敏感性。但双基因缺失突变体并没有导致对水稻致病力的进一步下降。综上所述,本研究鉴定了稻瘟病菌中GSNOR和黄素血红蛋白编码基因MoSFA1和MoHB1,并对它们在稻瘟病菌抵御NO和氧化胁迫、生长发育和致病过程中的功能进行了探索。结果表明,MoSFA1基因缺失造成对NO胁迫超敏感,导致突变体SNOs异常积累,即突变体蛋白质具有更高的蛋白质S-亚硝基化修饰水平;MoSFA1基因缺失影响附着胞膨压导致侵染率下降,影响抗氧化酶系统活性导致突变体抗氧化能力下降,从而使得突变体在生长发育上的缺陷和对水稻致病力的下降。此外,MoSFA1基因缺失也影响了突变体氮素的同化。MoHB1基因缺失造成对NO和H202胁迫超敏感,与MoSFA1基因相比MoHB1基因在应对外源NO胁迫中发挥更重要的作用。MoHB1和MoSFA1双基因缺失加重了对NO和氧化剂的敏感性,但是并不导致对水稻致病力的进一步丧失。总之,MoSFA1介导的NO降解途径在稻瘟病菌正常发育和致病过程中发挥着重要作用,而MoHB1则被用于回避外源NO胁迫。本研究的结果对于进一步揭示稻瘟病菌中NO的功能及稻瘟病菌致病机制具有重要意义,并可为稻瘟病新型防治药物的设计奠定理论基础。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S435.111.41

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 ;A simple and effective method for total RNA isolation of appressoria in Magnaporthe oryzae[J];Journal of Zhejiang University(Science B:An International Biomedicine & Biotechnology Journal);2008年10期
2 ;NO-mediated hypersensitive responses of rice suspension cultures induced by incompatible elicitor[J];Chinese Science Bulletin;2003年04期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前6条
1 梁鹏;李响;何其光;刘文波;缪卫国;郑服丛;;橡胶树白粉病菌在疏水介质表面的侵染特征和RNA提取[J];热带生物学报;2017年02期
2 ;对比分析黑斑息肉综合征合并大肠癌组织肿瘤相关基因(英文)[J];Chinese-German Journal of Clinical Oncology;2011年08期
3 ;Effects of Nitric Oxide on the Quality and Pectin Metabolism of Yali Pears During Cold Storage[J];Agricultural Sciences in China;2011年07期
4 ;Involvement of nitric oxide signaling in mammalian Bax-induced terpenoid indole alkaloid production of Catharanthus roseus cells[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2007年06期
5 徐茂军;董菊芳;;哺乳动物Bax基因依赖NO信号途径诱发长春花细胞中生物碱合成[J];中国科学(C辑:生命科学);2007年06期
6 ;Involvement of NO in fungal elicitor-induced activation of PAL and stimulation of taxol synthesis in Taxus chinensis suspension cells[J];Chinese Science Bulletin;2004年10期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 卢建平,刘同宝,于晓云,林福呈;Representative appressorium stage cDNA library of Magnaporthe grisea[J];Journal of Zhejiang University Science;2005年02期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 郑小波,张正光;稻瘟病菌无性重组研究[J];云南农业大学学报;2000年03期
2 董继新,董海涛,何祖华,李德葆;一个水稻与稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)互作相关新基因的克隆[J];农业生物技术学报;2001年01期
3 余艺涛;稻瘟病生理小种田间鉴测及防治策略[J];湖北农业科学;2003年06期
4 邱福林,王大为;稻瘟病菌致病机理的研究进展[J];垦殖与稻作;2004年03期
5 高朝斌;稻瘟病高发原因及防治对策[J];福建农业;2005年06期
6 孟军,赵明富,何月秋;稻瘟病菌重组研究概要[J];江西农业大学学报;2005年03期
7 王伟新;福建省2004年稻瘟病发生原因及防治对策[J];福建农业科技;2005年02期
8 张永庆;赵明富;何月秋;;稻瘟病菌诱导突变研究进展[J];云南农业大学学报;2006年01期
9 朱水财;;稻瘟病的发病症状与防治[J];福建稻麦科技;2006年03期
10 任金平;郭晓莉;郑民;杨晓辉;刘小梅;李莉;孙辉;;吉林省稻瘟病菌对水稻品种的致病谱研究[J];吉林农业科学;2006年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 宋雯雯;张正光;王源超;郑小波;;稻瘟病菌SNARE蛋白Mgsec22功能分析[A];中国菌物学会2009学术年会论文摘要集[C];2009年
2 刘文平;王嘉琪;李彦利;王海;温嘉伟;任金平;王继春;;中国东北吉林省稻瘟病菌与水稻品种互作研究[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
3 陈继圣;郑士琴;郑武;周洁;鲁国东;王宗华;;全基因组预测稻瘟病菌的分泌蛋白[A];中国植物病理学会2006年学术年会论文集[C];2006年
4 张世宏;靳春鹏;阳晓红;魏毅;刘金亮;潘洪玉;赵文生;彭友良;;东北极端低温对稻瘟病菌的致变效应分析[A];中国植物病理学会2008年学术年会论文集[C];2008年
5 杨俊;刘杏忠;;稻瘟病菌一个新基因的分子功能研究[A];2010年中国科学院微生物研究所博士后学术年会暨第二届博谊论坛论文摘要集[C];2011年
6 徐鑫;龙子文;赵传纪;刘新琼;王春台;;武陵山区稻瘟病菌生理小种文库的构建及初步鉴定[A];中国植物病理学会2012年学术年会论文集[C];2012年
7 刘晓梅;郭晓莉;姜兆远;李莉;孙辉;任金平;;2008年吉林省稻瘟病菌生理小种监测及致病性分析[A];公共植保与绿色防控[C];2010年
8 林成增;周洁;郑祥梓;王琴秋;何守贵;王宗华;鲁国东;;稻瘟病菌几丁质酶家族基因功能研究[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
9 朱晓寒;周腾胜;陈继圣;王宗华;;稻瘟病菌中一个假定的ADP核糖基化因子ARF6的功能分析[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
10 甘代耀;翁启勇;王乌齐;江文清;;稻瘟病菌致病性及抗病育种[A];“植物保护21世纪展望”——植物保护21世纪展望暨第三届全国青年植物保护科技工作者学术研讨会文集[C];1998年
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1 宋海峰方又平;江西 严把种子关控制稻瘟病[N];农民日报;2008年
2 农业植保专家 任金平;用水稻品种混栽技术控制稻瘟病[N];吉林农村报;2014年
3 植保专家 任金平;稻瘟病传播途径及防治措施[N];吉林农村报;2014年
4 屈明光 曾德禄;生物多样性控制稻瘟病研究获重大突破[N];农民日报;2000年
5 田伯光;日本发现抗击稻瘟病基因[N];农民日报;2010年
6 本报记者 汪波;攻克稻瘟病[N];人民日报;2001年
7 曾德禄 王立新;我省利用生物多样性控制稻瘟病研究获重大突破[N];云南科技报;2000年
8 冯国明;近年稻瘟病为何高发[N];湖南科技报;2007年
9 ;保护性稻瘟病防治剂——三环唑[N];四川科技报;2001年
10 涂飞;水稻病害防治[N];四川科技报;2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张勇;稻瘟病菌精氨酸合成途径基因的功能分析及稻瘟病菌代谢组学的研究[D];浙江大学;2015年
2 环晶;粳稻地方品种薄稻苗期抗稻瘟病的遗传分析与QTL定位[D];南京农业大学;2012年
3 王妍;水稻品种抗稻瘟病等位基因鉴定及抗瘟新基因的定位和克隆[D];沈阳农业大学;2015年
4 齐尧尧;稻瘟病菌Rab蛋白的定位与生化功能分析[D];福建农林大学;2015年
5 田红刚;黑龙江省稻瘟病菌致病性和品种抗性改良研究[D];沈阳农业大学;2016年
6 张震;稻瘟病菌MoSFA1和MoHB1基因鉴定与功能分析[D];南京农业大学;2015年
7 汤蔚;非折叠蛋白反应相关基因MoHAC1和MoIRE1在稻瘟病菌生长发育和致病过程中的功能分析[D];南京农业大学;2015年
8 杨娇艳;稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)14α-去甲基化酶与抑制剂的结合特性与新型杀真菌剂筛选[D];华中师范大学;2008年
9 周江鸿;我国稻瘟病菌新鉴别体系的构建及水稻抗稻瘟病基因的分子标记[D];中国农业科学院;2003年
10 王立安;钙信号传导途径参与稻瘟病菌生长及致病性的调控[D];南京农业大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 田家顺;苯甲酸对稻瘟病菌作用机制初探[D];湖南农业大学;2009年
2 许鸣一;稻瘟病菌四种生理小种的形态和生长特性研究[D];哈尔滨工业大学;2011年
3 夏令治;超级早稻中早39的抗稻瘟病遗传机理研究[D];中国农业科学院;2015年
4 陈杰;西南地区稻瘟病菌对稻瘟灵和吡唑醚菌酯的抗性监测及抗性机理[D];西南大学;2015年
5 童源;稻瘟病孢子图像识别算法研究[D];哈尔滨工业大学;2015年
6 黄鹏云;组蛋白H3甲基化模式在稻瘟病菌发育和致病过程中的功能分析[D];浙江大学;2015年
7 易军;稻瘟病菌对水稻光合特性和产量的影响研究[D];西南科技大学;2015年
8 谢倩凤;稻种资源的抗瘟性评价及分子标记鉴定[D];广东海洋大学;2015年
9 李莹;抗稻瘟病早粳稻空育131(Pid2/Pid3)的培育[D];黑龙江大学;2015年
10 唐郑华;稻瘟病菌Rho3互作蛋白的筛选和功能分析[D];福建农林大学;2012年
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