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大豆疫霉G蛋白α亚基调控游动孢子趋化性的机制研究

张鑫  
【摘要】:大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染大豆引起的根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。大豆疫霉的游动孢子释放后,可以特异地识别寄主分泌的异黄酮类物质,通过趋化性寻找寄主并启动侵染过程。因此趋化性是大豆疫霉完成侵染循环的关键环节。解释疫霉菌趋化性的分子机理对寻找新的杀菌剂靶标具有重要价值。本课题组前期研究发现PsGPA1编码的G蛋白α亚基参与调控游动孢子趋化性,但对其下游信号通路的了解还非常有限。因此,本研究综合利用亲和纯化、质谱鉴定及基因沉默等技术对大豆疫霉G蛋白α亚基调控游动孢子趋化性的机制进行了探索,鉴定到了一系列潜在的PsGPA1互作蛋白,并利用基因沉默的方法针对其中PsHint1的功能进行了研究。PsGPA1互作蛋白的筛选与鉴定:为了分析PsGPA1介导的信号转导通路及分子机制,本研究对PsGPA1的互作蛋白进行了筛选。本文在大豆疫霉中成功表达了融合FLAG标签的PsGPA1,并利用亲和纯化的方法来筛选大豆疫霉中与PsGPA1物理互作的蛋白。通过质谱分析,鉴定到了一系列候选蛋白,如HIT核苷酸结合蛋白PsHint1和谷氧还蛋白PsGrx1,并分别对其结构特点进行了分析。随后成功在原核中对候选蛋白及PsGPA1进行了表达,并利用GST pull-down的方法对亲和纯化的结果进行了验证。实验结果证实了PsHint1与PsGPA1的互作关系,但PsGrx1与空载体对照也存在互作,因此PsGrx1与PsGPA1的互作关系有待进一步验证。PsPGA1的互作蛋白PsHint1参与调控大豆疫霉的趋化性及致病性:在前文中鉴定到了一个PsGPA1的互作蛋白,PsHint1。其具有一个HIT结构域,且为人类HINT1的同源蛋白。为了对蛋白间的体内互作进行分析从而验证前一章的结果,本研究建立了疫霉蛋白共表达体系,成功构建了PsHint1与PsGPA1的共表达载体并进行了大豆疫霉转化,随后的co-IP实验证实了PsHint1与PsGPA1的互作。本研究同时利用体外GST pull-down的方法对二者的关系进行了验证。实验结果显示,PsHint1与GTP或GDP结合状态下的PsGPA1均可以发生互作。本文对PsHint1的转录模式、亚细胞定位及生物学功能进行了分析。结果显示,PsHint1在侵染阶段上调表达;其在大豆疫霉细胞核、细胞膜及细胞质内均检测到定位。利用基因沉默的方法对PsHint1进行功能分析发现,其参与调控游动孢子对大豆根毛及异黄酮类物质的趋化性。PsHint1沉默转化子的休止孢萌发异常,产生了高度分枝或末端膨大的芽管。在与大豆感病品种Hefeng 47互作过程中,PsHint1的沉默使得转化子对于寄主的致病力显著减弱,侵入菌丝在大豆表皮细胞内的扩增受到了显著抑制,并导致侵染点附近的大豆细胞出现了坏死反应。PsHint1沉默转化子与PsGPA1沉默转化子致病力减弱的原因并不相同。这些结果说明PsHint1不仅通过与PsGPA1互作来调控游动孢子趋化性,还参与了一条不依赖Gα的调控致病性的信号通路。致病相关蛋白PsHint1参与调控的下游信号通路分析:为了进一步分析PsHint1调控大豆疫霉致病过程的分子机制,本文对其沉默转化子致病力减弱的原因进行了进一步分析。实验结果证实转化子对氧化压力胁迫的敏感性显著上升。DAB染色试验表明PsHint1沉默转化子丧失了清除侵染点周围ROS的能力,而采用NADPH氧化酶抑制剂DPI清除大豆表皮细胞产生的ROS后,可以部分恢复PsHint1沉默转化子的侵入菌丝在大豆细胞中的扩展能力。此外,qRT-PCR结果证实,PsHint1的沉默导致部分RxLR效应分子转录模式异常。本研究对PsHint1沉默转化子侵染3小时阶段的样品进行了RNA-seq分析,所获得的数据与qRT-PCR结果相符。RNA-seq数据显示,在PsHint1沉默转化子中,大量激发子类似基因上调表达,PsHint1的沉默还影响了部分转录因子的转录。由此可以推测,PsHint1可能通过调控ROS的清除、RxLR效应分子的转录及激发子类似基因的表达来作用于大豆疫霉致病过程。本研究利用亲和纯化的方法对PsHint1的互作蛋白进行了筛选,鉴定到了HSP70、AGC蛋白激酶、核转运蛋白α及一系列蛋白翻译相关蛋白,它们与PsHint1的关系有待进一步验证。PsGPA1靶标蛋白的筛选及功能分析:大豆疫霉中编码G蛋白α亚基的基因PsGPA1在大豆疫霉趋化性及致病性进程中起着关键作用。在前期实验中,本研究对PsGPA1的互作蛋白进行了筛选,但所得到的结果尚未能解释PsGPA1行使复杂功能的分子机制。因此,本研究对原有的亲和纯化方法进行了优化,在大豆疫霉PsGPA1-FLAG转化子的蛋白裂解液中外源添加了GTP抗水解类似物GTPγS,从而人为地使Gα处于激活状态,旨在进一步寻找PsGPA1的下游靶标蛋白。通过该方法我们鉴定到了多个蛋白激酶(PsSNF1和PsYPK2)、一个蛋白磷酸酶(PsPPEF)及一个小G蛋白(PsRABB1)。GST pull-down也进一步证实了以上4个候选蛋白与PsGPA1的互作关系。对以上候选靶标的转录模式进行分析后发现,该四个基因均在大豆疫霉侵染阶段上调表达,暗示了它们可能参与调控大豆疫霉的致病过程,从而可为后期的基因功能验证提供线索。以上四个候选蛋白的生物学功能有待进一步研究。本研究利用亲和纯化的方法对PsGPA1的互作蛋白进行了鉴定,并在此基础上进行了体系优化,以期筛选PsGPA1的下游靶标蛋白。该实验体系有望为疫霉菌其它基因的互作蛋白筛选提供重要的参考。本研究在疫霉菌中对G蛋白下游信号通路进行了鉴定,并发现G蛋白α亚基的互作蛋白PsHint1同样参与调控游动孢子的趋化性,但其以与PsGPA1不同的方式作用于大豆疫霉的致病过程。本研究可为揭示疫霉菌中Gα调控趋化性的分子机制提供重要的线索,同时亦可增进对大豆疫霉早期致病机理的认识,从而为新的疫病控制策略的开发提供帮助。


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