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《南京农业大学》 2016年
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高产杆菌肽地衣芽胞杆菌的鉴定与选育

贾锐  
【摘要】:抗菌肽(Antimicrobial peptide)是一类广泛存在于自然界生物体中的小肽类物质,它是机体先天性免疫系统的重要组成部分。抗菌肽具有独特杀菌机制和广谱抗菌性,不易造成病原菌的耐药性。一些抗菌肽对肿瘤细胞有广谱杀灭活性,为癌症患者提供了一类新型的抗癌药物,其在医药、养殖、食品、生物防治等方面有很高的应用价值。本实验拟从天然界筛选得到1株抑菌活性较强、抑菌谱较广的芽胞杆菌,并通过分离纯化得到其主要抑菌活性物质,再通过全基因组改组方式提高其主要活性物质产量。主要研究结果如下:1.抗菌活性芽胞杆菌的筛选与鉴定:从天然原桃胶中分离到一株有抑菌活性物质的芽胞杆菌TJ12。其发酵产物对金黄色葡萄球菌(StapHylococcus aureus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、蜡样芽胞杆菌(Bacallus cereus)和串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)有抑菌活性。结合菌落形态、生理生化指标、16S rRNA序列和gyrB序列将TJ12菌株鉴定为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)。2.抑菌活性物质的分离纯化与鉴定:通过硫酸铵分级沉淀、有机溶剂萃取、羟丙基葡聚糖凝胶层析、高效液相色谱分离纯化,得到其主要活性物质。该物质对pH、温度和三种蛋白酶(胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶)有较好的稳定性。经电喷雾电离质谱分析,初步鉴定该株地衣芽胞杆菌TJ12的主要抑菌物质为杆菌肽A。3.基因改组选育高产杆菌肽地衣芽胞杆菌及改组菌株差异分析:为了提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量,采用全基因组改组技术进行菌株选育。以地衣芽胞杆菌TJ12为原始菌株,通过紫外(UV)诱变、亚硝基胍(NTG)诱变、常压室温等离子体(ARTP)诱变构建了 TJ12菌的突变体库。在优化其原生质体制备和再生条件的基础上,以其中4株诱变菌株(U11、U23、H1、L71)作为亲本,采用聚乙二醇(PEG)介导的方法进行三轮多亲本的全基因组改组,同时,结合双亲灭活的筛选方法,最终选出1株杆菌肽产量提高并能稳定遗传的优良菌株F3,其摇瓶水平发酵36 h,杆菌肽A产量达760mg/L,为野生菌株TJ12的1.7倍。与野生菌株TJ12相比,改组株提前进入生长稳定期,两者发酵过程pH几乎无差异;最终菌体生长量虽低于野生菌,但单位菌体还原糖产量及杆菌肽产量都高于野生菌株;其合成基因和调控基因表达量相对野生菌株都上调,其中合成基因上调幅度较大。推测改组菌株自身有了更强大的杆菌肽耐受机制,且合成基因相关部位可能发生了改变。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:TS201.3

【参考文献】
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