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DON对小鼠骨髓源性树突状细胞的细胞表型和免疫功能的影响

夏兵兵  
【摘要】:脱氧血腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)主要是由禾谷镰刀菌在生产过程中产生的有毒代谢产物,是食品和饲料中最常见的毒素之一。DON具有免疫毒性,人和家畜长期暴露DON毒素会导致免疫功能紊乱,对其健康造成极大的危害。树突状细胞(dendritic cell,DC)目前是体内最强的抗原提呈细胞,是特异性免疫应答的启动者,对细胞免疫和体液免疫都有着重要的调节作用。本论文以GM-CSF和IL-4联合培养的小鼠骨髓源性DC为基础,研究DON对LPS诱导小鼠骨髓源性DC的表型和免疫功能的影响,阐述DON引起机体免疫抑制的机制,为更进一步研究真菌毒素引起机体免疫抑制的机制提供试验依据。试验一体外诱导培养小鼠骨髓源性树突状细胞通过GM-CSF(10 ng·mL~(-1))和IL-4(10 ng·mL~(-1))联合诱导小鼠骨髓细胞,细胞培养至第7天,倒置显微镜观察可见几个或十几个细胞聚集形成大小不一的集落,集落周围可见树突状突起,经流式细胞仪检测,DC纯度达到80%左右,可以满足后续试验的要求。试验二DON对小鼠骨髓源性树突状细胞的形态及表型的影响本试验利用培养好的DC,进行染毒试验。试验分为为空白组、LPS组和DON组,其中DON组有三个浓度梯度,分别为125、250和500 ng·mL~(-1),每个组设置三个重复孔。LPS组:加1 μg·mL~(-1) LPS培养24h,作为阳性对照组;DON组:先加DON培养6 h之后,再加LPS继续培养18 h。24 h后,用显微镜观察细胞的形态学变化,CCK-8法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞表型的变化。结果显示:显微镜镜下观察,LPS组形成较大的集落,周围有很长的毛刺状树突;在125和250 ng·mL~(-1) DON组中,细胞形成集落并且周围有毛刺状树突;但是,在500 ng·mL~(-1) DON组中,细胞形成集落,而周围没有毛刺状树突。LPS刺激组与空白组比较,细胞活性没有降低(p0.05);在125和250 ng·mL~(-1) DON组中,细胞活性也没有降低(p0.05),然而在500 ng·mL~(-1) DON组中,细胞活性降低(p0.05)。通过流式细胞仪检测,LPS组细胞表面上的CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达与空白组比较,显著提高(p0.05);在125和250 ng·mL~(-1) DON组中,细胞表面上CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达与LPS组比较,差异性不显著(p0.05),而在500 ng·mL~(-1) DON组中,对细胞表面上CD80、CD86和MHC-II表达显著性降低(P0.05)。试验三DON对小鼠骨髄源性树突细胞免疫功能的影响本试验利用培养好的DC,进行染毒试验。试验分为为空白组、LPS组、DON组,其中DON组有三个浓度梯度,分别为125、250和500 ng·mL~(-1),每个组设置三个重复孔。LPS组:加1μg·mL~(-1) LPS培养24h,作为阳性对照组;DON组:先加DON培养6h之后,再加LPS继续培养18h。24h后,检测细胞上清中NO浓度,实时荧光定量检测细胞因子表达,吞噬右旋葡聚糖能力的检测。结果显示:上清中NO浓度随着DON剂量升高而降低。DON与LPS组比较,在125和250 ng·mL~(-1) DON组中,IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α的mRNA表达量没有显著性差异(p0.05),然而,在500 ng·mL~(-1) DON 组中,IL-6、IL-10、IL-12 和 TNF-α 的 mRNA 表达量显著性降低(P0.05)。125和250 ng·mL~(-1) DON对DC吞噬右旋葡聚糖能力与LPS组比较,几乎没有变化,而在500 ng·mL~(-1) DON吞噬右旋葡聚糖能力提高了 12.2%。


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