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《南京农业大学》 2016年
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水稻叶色白化基因BH6的图位克隆

王卓然  
【摘要】:水稻是世界上最主要的粮食作物之一,同时也是禾本科重要模式作物,具有重要的实用和科研价值。水稻叶片是光合作用的主要场所,也是理想株型的关键构成因素,对叶色相关基因进行克隆和功能分析既可以用于研究光合作用的生理生化机制,又可用来进行高光效育种以提高水稻产量。氨酰tRNA合成酶是参与催化蛋白合成过程并确保mRNA的遗传信息准确无误翻译成蛋白质序列的一类关键酶,此外,氨酰tRNA合成酶还具有参与基因表达的调控和rRNA合成等重要作用。目前,关于氨酰tRNA合成酶是如何参与叶绿素合成以及影响光合作用的机制尚未明确。本研究以一个叶色白化致死突变体(baihua6,bhb)为材料,通过图位克隆方法确定BH6基因编码一类氨酰tRNA合成酶,经过对bh6的表型观察和该基因的功能分析,我们得到了以下结果:1.本文的白化致死突变体bh6为粳稻品种宁粳4号的化学诱变所得,经过大田播种生长、培养箱培养后移栽至大田,以及在光照培养箱持续培养生长,我们发现该突变体叶片始终保持稳定的白化,后期叶色不能转绿最终致死,并且该表型不随外界温度的变化而改变。叶绿素含量测定和叶绿素自发荧光观察都证明了该突变体与野生型存在明显的叶绿素含量差异。2.通过电子透射显微镜观察了野生型和突变体叶片细胞中叶绿体的超微形态结构,结果发现与野生型相比,突变体中的叶绿体存在明显的结构缺陷,表现为类囊体结构的异常,并伴随着嗜锇颗粒的增加,最终导致其光合能力的丧失。3.对BH6基因进行了遗传分析,结果表明杂合基因的植株后代正常与白化单株分离比符合3:1,该基因是隐性单基因控制的,随后用杂合单株为母本,籼稻品种N22为父本杂交构建F2群体来精细定位BH6基因,利用F2群体中的318个白化极端个体将该基因精细定位在到第六号染色体顶端到分子标记Bh6-12之间物理距离为266 kb的区间内。通过网站RiceXPro预测定位区间内的基因,根据注释初步判定ORF4与ORF15与叶绿体相关,通过测序发现候选基因ORF15(Os06g0103600)的第六个外显子中发生了单碱基突变,ORF15可能就是白化表型的候选基因。随后利用CRISPR技术对野生型ORF15基因进行敲除实验,获得的阳性转基因植株也表现出bh6突变体相似的白化表型,表明Os06g0103600的突变就是导致bh6突变体呈现白化的原因。4.通过网站上对该基因表达蛋白的序列分析比较,发现该基因编码一个甘氨酰tRNA合成酶,这种酶包含四个结构域,而发生突变的位点位于其中各物种间最为保守的α核心结构域,该基因的突变很可能导致α核心结构域中的活性位点的改变导致酶活性的丧失,进化树分析表明该基因编码的这一类蛋白广泛存在于高等植物中,并且同源性较高,证明了该基因在进化中具有高度的保守性。5.通过荧光定量RT-PCR分析,检测了整个叶绿体发育互作调控网络中各基因在bh6突变体中的表达水平的变化情况,包括叶绿体发育相关基因和叶绿素合成代谢相关基因的定量分析,结果表明与野生型相比,由于该基因的突变导致整个互作调控网络中的基因表达在突变体中都受到了一定影响。水稻中氨酰tRNA合成酶的相关研究还不是很多很明确,本研究中的BH6是一个新的控制叶绿体发育的基因,通过本研究结果我们初步阐明甘氨酰tRNA合成酶在叶绿体发育过程中所起到的作用,为进一步解析叶绿素合成途径提供了理论基础。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S511

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