伪狂犬病病毒gE基因缺失株（LA-A株）的构建及免疫效力研究

【摘要】：猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的猪的一种以发热、脑脊髓炎、呼吸系统和神经系统障碍为主要特征的急性、热性传染病。免疫接种基因缺失株的弱毒疫苗是防控伪狂犬病的有效途径之一。然而,自2011年以来,新的猪伪狂犬病疫情在中国北方的某些猪场最先爆发,尽管这些猪场都免疫过了 Bartha-K61株等PRV疫苗,之后疫情逐步向全国大部分养猪场蔓延。研究表明此次疫情是由毒力明显变强的PRV变异毒株引起的。有研究结果显示PRV弱毒疫苗Bartha-K61虽然仍能提供一定的临床保护,但不能提供足够的保护力以完全抵御此次流行的毒株,尤其对攻毒后的排毒保护效果很不理想。因此研制出一种针对PRV变异株的新型疫苗是我国养猪业的紧迫需求。本研究室从安徽省六安市某猪场的发病猪中分离了一株猪源伪狂犬病病毒株,该毒株能引起9周龄仔猪发病死亡,其毒力显著增强,命名为AH02LA株。进一步以PRV AH02LA株基因组DNA为模板,分别扩增出gE基因两侧的序列HI、H2作为同源重组臂,以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)为筛选标记,构建了GFP转移载体质粒pPRV-GFP(gE-)。采用磷酸钙吸附法将pPRV-GFP(gE-)DNA与PRV-AH02LA病毒DNA共转染原代CEF细胞,转染24小时后在紫外光,(波长488nm)激发下观察细胞病变,挑取发出绿色荧光的蚀斑,经过3～4轮挑斑筛选和传代,获得纯化的的重组病毒,命名为PRVAH02LA-GFP(gE-)。然后构建质粒pUC19-(PRV gE-)R,该质粒包含完整的gI基因和gE基因ORF的一部分(1299bp-1735bp)以及上下游序列,同样采用磷酸钙吸附法将pUC19-(PRV gE-)R DNA与重组病毒PRV AH02LA-GFP(gE-)DNA共转染原代CEF细胞,转染24h后在紫外光(波长488nm)激发下观察细胞病变,挑取不发绿色荧光的蚀斑,经过2～3轮挑斑筛选和传代,获得纯化的伪狂犬病病毒gE单基因缺失株,命名为伪狂犬病病毒LA-A株。对伪狂犬病病毒gE基因缺失株(LA-A株)的部分生物学特性进行了鉴定。将PRV LA-A株分别感染CEF和BHK-21细胞,观察病变情况并绘制PRV LA-A株在CEF和BHK-21细胞的生长动力学曲线;用TCID50法检测CEF和BHK-21细胞的病毒效价,结果显示,PRVLA-A株在CEF和BHK-21细胞中均能增殖,达到较高的病毒效价,PRV LA-A株感染CEF细胞的病毒效价平均为106.5TCID50/mL,感染BHK-21细胞的病毒效价平均为107.8TCID50/mL。病毒的生长动力学显示,PRV LA-A株在CEF和BHK-21细胞上有相似的增殖周期,即在接毒一定时间内增殖能力显著上升,其后增殖平缓,甚至下降;但增殖效价有较大差异;从病毒的体外生长曲线可以看出,gE基因缺失病毒PRV LA-A株和亲本病毒AH02LA株具有相似的生长动力学,在36h～48h都达到峰值,滴度最高可达109.5TCID50/mL以上,说明gE基因的缺失对病毒的复制几乎没有影响。安全性试验表明伪狂犬病病毒LA-A株对4周龄仔猪安全,且可以通过常规鉴别诊断方法区别伪狂犬病病毒LA-A株免疫猪只与自然感染猪只。对伪狂犬病病毒gE基因缺失株(LA-A株)灭活疫苗与伪狂犬活疫苗(Bartha-K61株)进行免疫效力比较研究,免疫攻毒试验结果表明免疫Bartha K61株疫苗对免疫组猪仅能产生部分保护,不能阻止发病和排毒。而接种LA-A株疫苗的所有猪只能产生对PRV野毒株AH02LA株的完全的临床保护,攻毒后排毒的时间大大缩短,强度显著下降。表明PRV LA-A株作为疫苗株显著优于BarthaK61株。伪狂犬病病毒gE基因缺失株(LA-A株)灭活疫苗小鼠效力检验表明PRV LA-A株对小鼠具有很好的免疫效力,对50LD50剂量的PRV AH02LA株能达到完全的保护。