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《南京农业大学》 2013年
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萝卜抽薹开花相关基因克隆与功能分析

许园园  
【摘要】:萝卜(Raphanus sativus L.)为起源于我国的一、二年生十字花科蔬菜作物,其栽培历史悠久,分布广泛,在我国种植面积位居前列。萝卜具有低温通过春化、高温长日照促进抽薹开花的特性,使得春季市场上萝卜供应非常紧俏。目前,对于十字花科蔬菜作物抽薹开花特性研究远远落后于对模式作物的研究,并且多局限于栽培技术和激素调控方面。在萝卜中有关抽薹开花分子机制及调控研究等方面均鲜有报道。本文基于模式作物抽薹开花研究结果,采用电子克隆与Genome Walking等策略分离出抽薹开花基因的gDNA、cDNA及启动子序列,并进行表达特征分析及转基因功能验证,研究结果将为阐明萝卜抽薹开花分子机理提供理论和技术支持。主要研究结果如下:1.以早抽薹品种'NauDY13'和晚抽薹品种'NauXXXS'为试材。设计特异引物,采用PCR及RT-PCR技术,分别在早抽薹材料'NauDY13'及晚抽薹材料'NauXXXS'中克隆得到萝卜的FT基因DNA,cDNA及启动子序列,该基因DNA分别为2181 bp和2173bp,其cDNA序列相同,其5'端上游序列分别为543bp和548bp,利用生物信息学在线软件对序列进行预测和分析。结果表明:利用DNAMAN软件分析RsFT与已报道的其他作物FT及其同源基因均有不同程度的同源性;利用PLACE和PlantCARE在线软件分析发现这两个序列相似性为98.7%,均含有典型的启动子调控元件及其他的顺式调控元件,表明RsFT基因的表达受光照等因素的调控,另外晚抽薹材料中获得的FT基因5'上游序列中还预测到顺式元件TCT-motif。转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导后产生了预期大小的重组蛋白。亚细胞定位分析结果表明,携带有RsFT重组载体的GFP分布在洋葱表皮的细胞核和细胞质膜上。实时定量RT-PCR分析表明,开花期RsFT基因在茎、叶、叶柄、嫩英、花蕾以及花中都有表达,而开花前期在叶中表达量相对最大,早晚抽薹材料在开花前与开花后表达总体趋势一致,表达量上存在差异。由RsFT与RsFLC表达互作分析推测RsFLC基因不受光周期变化的影响。RsFT基因受到春化作用的影响。构建了RsFT基因的转基因过表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,T1代植株表型统计结果显示,转化RsFT基因的烟草植株开花时间较对照明显提前,表明萝卜RsFT基因有促进开花的作用。2.以早抽薹品种'NauDY13'及晚抽薹品种'Naulul27'为试材。采用PCR,RT-PCR方法,克隆得到了萝卜早抽薹材料'NauDY13'RsFLC1基因及晚抽薹材料'Naulu127'RsFLC2基因,该基因DNA全长分别为3046bp和2959bp,其cDNA序列均包含594bp的开放阅读框,编码197个氨基酸。利用Genome Walking的方法,分别获得了 1466bp和1744bp的5'端上游序列,命名为PRsFLC1和PRsFLC2。本研究为了验证早晚抽薹材料中启动子功能,构建了 一系列PRsFLC1和PRsFLC2启动子缺失载体并分别与GUS基因融合,组织化学GUS染色结果表明,转入PRsFLC1-(1 to 4)-GUS-PS1aG-3 和 PRsFLC2-(1 to 5)-GUS-PS1aG-3 载体的烟草叶盘中检测到了GUS活性。构建了转RsFLC基因过表达载体转化烟草,T1形态统计观察初步表明,与野生型相比,转入RsFLC基因的烟草植株表现明显的晚花现象。3.克隆到RsCO与RsFPF1基因组DNA及cDNA序列。经序列测定和分析表明,RsCO编码307个氨基酸,RsFPF1编码109个氨基酸;采用Genome Walking的方法获得萝卜RsCO基因上游启动子区域长1381bp。获得RsFPF1基因上游启动子区域长1845bp。以萝卜'NauDY13'为材料研究了RsCO与RsFPF1基因在开花前后不同组织部位的表达差异。结果表明,开花前,RsCO基因在叶和叶柄中表达量最大;RsFPF1基因在茎尖表达量最大;而开花后,RsCO在花及花蕾中表达量最大;RsFPF1在花及花蕾中表达量最大。构建转基因过表达载体转化烟草,转基因植株T1形态统计观察初步表明,与野生型相比,转入RsCO与RsFPF1基因的植株出现花期提前现象。4.克隆到RsAP1与RsSVP基因的DNA及cDNA序列。经序列测定和分析表明RsAP1编码259个氨基酸;RsSVP编码241个氨基酸;采用基因组步移的方法获得萝卜RsAP1基因上游启动子区域长1409bp,RsSVP基因上游启动子长1640bp。预测分析表明,这些启动子都含有启动子的特定结构及多个转录因子结合位点。以萝卜'NauDY13'为材料进行表达分析结果表明,开花前,RsAP1基因在茎尖高水平表达;RsSVP基因在茎、茎尖、叶高水平表达;开花后,RsAP1基因在茎和花蕾中高水平表达;RsSVP则在茎,叶柄及新叶中有表达。5.克隆到RsTFL1基因组DNA及cDNA序列及RsTSF基因cDNA序列,经序列测定和分析表明,RsTFL1编码177个氨基酸;RsTSF编码176个氨基酸;采用基因组步移的方法获得RsTFL1上游启动子区域645bp。在线软件预测其含有启动子的特定结构及多个转录因子结合位点。另外构建了RsTSF转基因过表达载体并通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,获得抗性的阳性转基因植株,形态统计观察初步表明,与野生型相比,转入RsTSF基因的植株则出现花期提前现象。6.评价了 8个萝卜候选内参基因在27个萝卜材料中的表达稳定性,用统计学软件geNorm和NormFinder分析发现,TEF2,RPⅡ和ACT在所有的参试样品组合中均表达稳定,可以用于萝卜早晚抽薹开花相关基因的表达分析。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S631.1

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