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凤仙花坏死环斑病毒单克隆抗体的制备与番茄斑萎病毒云南样品的田间检测

孙立华  
【摘要】:凤仙花坏死环斑病毒(Impatiens necrotic spot virus,INSV)与番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus.TSWV)同属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae),番茄斑萎病毒属(Tospovirus)。两者均有广泛的寄主范围,西花蓟马(Frankliniella.occidentalis)是它们共同的传播介体。两种病毒在侵染植物后的症状上有很多的相同之处,主要表现为:植株矮化,茎或叶片上出现环状或紫褐色的斑,茎会有腐烂现象,可以出现碎色花等。但是凤仙花坏死环斑病毒主要侵染花卉等观赏植物,而番茄斑萎病毒侵染蔬菜等重要农作物,两种病毒在全世界的大规模传播给栽培种植者带来了巨大的经济损失。为了制备凤仙花坏死环斑病毒单克隆抗体,将抗原注射入免疫小鼠体内,可以使其体内的脾细胞具有产生抗体的能力,但这种产生抗体的细胞并不具备癌细胞所具有的无限增殖的能力。如果在融合剂的作用下将两种能力不同的细胞进行细胞融合形成杂交瘤细胞,就会使其拥有这两种细胞的能力。再通过筛选得到只分泌我们所需要的抗体的单一 B淋巴细胞,对其单独进行培养,这样就能获得单克隆抗体。单克隆抗体具有很高的特异性,在肿瘤治疗方向上具有广泛的应用。本实验提取了感染INSV的植物总RNA,利用逆转录技术扩增cDNA,以其为模板扩增片段,插入到载体中成功构建了 pET28a-INSV-N表达载体。原核表达了INSV的外壳蛋白作为小鼠免疫的抗原,随后进行蛋白透析进行凝胶电泳分析后以1mg/mL的浓度与弗氏佐剂乳化后进行小鼠的腹腔注射。经5次免疫后,取小鼠尾巴上的静脉血并采用血清学检测方法中的ELISA方法进行效价测定,其中数值测定结果最高的小鼠的脾脏细胞可以与SP2/0进行融合实验,其中PEG1500为融合剂。融合7-10天后用有限稀释法进行细胞阳性克隆筛选,最后得到1E1与2D9两株杂交瘤细胞株。为保存株系,最好将筛选得到的细胞株放入液氮中进行冻存。一般使用体内培养法获得抗体,要将已筛选得到的杂交瘤细胞进行扩培繁殖以获得足量的细胞,随后将细胞注射进小鼠腹腔内以获得腹水。将腹水纯化后即得到所需要的单克隆抗体。得到的两株单抗用间接ELISA法检测效价,结果均为为1:250。为了检测番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus TSWV)在田间的发病态势,本实验从云南不同地区采集到了疑似TSWV侵染症状的样品,随后将病样叶在磷酸缓冲液中研磨,成功摩擦接种到本氏烟上。同时运用DOT-ELISA和RT-PCR两种方法鉴定 TSWV,可以发现YN-18、YN-11、YN-34、YN-26、YN-51、YN-61、YN-80、YN-65、YN-53、YN-42、LE 十一个样品中 YN-18、YN-11、YN-34、YN-53、YN-65和LE这6个样品带有TSWV病毒。两种检测方法得到了相同的检测结果。


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