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《南京农业大学》 2017年
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雄激素在小鼠睾丸微环境中对缝隙连接蛋白Cx43的调控机制研究

夏钦  
【摘要】:精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的健康直接影响畜牧的繁殖效率。精原干细胞的自我更新和分化受到多种因素的调节,尤其是来自睾丸微环境的调控信号。睾丸微环境是由两个或几个支持细胞包围着精原干细胞形成的特殊结构,在这些支持细胞间存在缝隙连接。缝隙连接蛋白Cx43作为缝隙连接的重要组成成分,在支持细胞上表达,而且作为血睾屏障中的重要组成部分参与对精原干细胞的调节。有研究报道,Cx43对生殖细胞的发育和精子的发生具有重要作用,但其调控机制尚不明确。本人通过免疫组织化学检测了 Cx43在小鼠睾丸内的表达情况,发现Cx43主要是在基膜附近的支持细胞中表达,此外在精原细胞与支持细胞之间,以及在42日龄小鼠睾丸中分化的精原细胞中也检测到了 Cx43的表达。随后我们提取了不同天数小鼠睾丸蛋白对Cx43的表达进行的分析,结果显示5日龄的Cx43表达较弱,到10日龄小鼠睾丸内Cx43的表达有所增加,到20日龄信号大幅增强,而42日龄小鼠睾丸内Cx43的表达略有下降。为了研究雄激素信号与Cx43的关系,本人通过体外添加雄激素或雄激素拮抗剂到TM4细胞和支持细胞中,分析雄激素对Cx43表达的影响,结果显示雄激素对Cx43表达存在正调控作用。实验室的前期结果显示,雄激素对WT-1也存在调控作用,因此我们通过ChIP-seq筛选了 WT-1的下游靶基因,并预测到了Cx43是WT-1的直接靶基因。为了验证这一结果,本人在支持细胞中进行WT-1过表达和WT-1干扰处理,并利用蛋白免疫印迹技术检测WT-1、AR、Cx43的表达情况,结果显示在支持细胞中WT-1对Cx43的表达存在负调控作用。为了验证这一结论,我们通过腹腔注射白消安构建无生殖干细胞的睾丸体内微环境模型,在体内水平进一步进行研究。六周龄雄性小鼠接受白消安注射后曲精小管内形成空腔,管内只剩下少数支持细胞存在于基膜处,免疫组织化学染色显示支持细胞中Cx43的表达不受影响,这说明白消安对生殖细胞有杀害作用,但对体内微环境基本上没有影响。我们随后通过向这一模型小鼠腹腔注射雄激素拮抗剂,分析在体内微环境中阻断雄激素对Cx43的表达影响。结果显示,阻断雄激素后导致曲细精管内的Cx43表达下降,从而证明在体内雄激素对Cx43的表达呈正调控的效果。综上所述,本研究发现睾九支持细胞中的雄激素能够通过WT-1对缝隙连接的关键蛋白Cx43的起到正调控作用,并发现Cx43是WT-1的直接靶基因,从而初步揭示了雄激素信号在调控支持细胞与精原干细胞之间相互作用的分子机制。本研究为加深认识精原干细胞微环境对精原干细胞的调控机理研究做出了铺垫,为养殖动物的繁育提供理论了依据,为雄性动物以及人类的生殖疾病提供了研究依据,为人类医学相关领域的研究提供了重要的参考价值。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S814.1

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