鸭肝炎病毒部分cDNA文库的构建及鸭IgG的特性

杨宗照  

【摘要】： 用蛋白酶K消化粗提的鸭肝炎病毒（DHV），酚-氯仿抽提后再与生物素化 Oligo（dT）杂交，通过共价结合有链霉亲和素的顺磁微珠捕获RNA-Oligo（dT） 杂合体，采用磁性分离技术，得到了高纯度的DHV RNA。经测定， OD_(260)/OD_(280)=2.2，琼脂糖凝胶电泳只有一条均一的核酸带，大小约为7—8kb。 用Oligo（dT）_(15)为引物，用禽反转录酶（AMV）反转录DHV RNA，合成了cDNA 用T4 DNA连接酶与接头连接，磷酸化后，与经EcoRⅠ酶切并去磷酸化的载 体pUC19连接成重组质粒，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，构建了DHV 部分cDNA文库，通过颜色筛选及小量质粒酶切的方法，共筛选到80个阳性 克隆，经酶切鉴定，插入片段大小为1—7kb。将部分阳性菌落的质粒测序， 并与小RNA病毒科的其它成员作序列比较，结果显示，鸭肝炎病毒与泰勒鼠 脑脊髓炎病毒（TMEV）接近。文库的构建和序列的测定丰富了DHV的分子 生物学内容，对它的研究意义深远。 为深入了解为何不能用鸭抗体来进行凝集或沉淀实验检测DHV，又进行 了鸭免疫球蛋白的研究。 用四周龄肉鸭静脉内两次注射绵羊红细胞（SRBC）或鸡红细胞（CRBC） 进行免疫，下蛋母鸭用更高剂量的CRBC进行静脉内注射免疫。免疫后收集 肉鸭血清，母鸭血清及母鸭后代的血清，用直接血凝实验测定它们对相应抗 原的滴度，结果发现鸭免疫CRBC产生的滴度稍高于SRBC，但是二者的滴 度都相当的低。母鸭首免后的后代血凝滴度极低，二免后滴度有所提高。用 牛血清白蛋白（BSA）皮下或静脉注射免疫鸭，虽然采用了各种措施，但免 疫后鸭血清的血凝效价都非常低；琼脂扩散实验没有出现沉淀线。 用辛酸-硫酸铵法提取鸭IgG，同时把该法与传统的提取方法进行了比 较，结果表明，该法提取的IgG纯度高，比色谱层析快速，简单，而且廉价。 本文也把几种提取鸡卵黄抗体的方法试用于提取鸭卵黄抗体。 通过比较，找到适合鸭IgG的提取方法，为进一步研究其性质奠定基础 通过对鸭卵黄抗体在不同温度下处理和在不同酸碱度下处理后发现， 鸭IgG在温度不高于70℃和pH4—12之间稳定，它可以耐受45％蔗糖渗透 压。这些特点表明鸭卵黄抗体比鸡的稳定性强。紫外光谱和荧光光谱进一步 揭示了其活性丧失的原因。将提纯的7.8S，5.7S IgG作薄板等电聚焦，结 果显示鸭IgG等电点为5.6，6.2，6.9，鸭IgG等电点与鸡IgY的等电点（5.2、 5.3、6.6）有差异。 推测可能是由于鸭IgG肽链间的作用力比较强，提高了它的稳定性，但 同时也减少了鸭IgG铰链区的柔韧性，使其在功能上成为单价，因而不能 发生凝集和沉淀反应。

【关键词】：鸭肝炎病毒 cDNA文库 免疫球蛋白
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2000
【分类号】：S852.65;S858.32
【DOI】：CNKI:CDMD:2.2000.005138
【目录】：

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