传染性支气管炎病毒青岛腺胃分离株（SD/97/02）全结构蛋白基因的克隆和序列分析

【摘要】： 实验选取了一株分离自有腺胃病变的较为特殊的传染性支气管炎病毒（IBV SD/97/02株）作为基本材料，对该毒株的生物学特性和分子生物学进行了研究。 利用RT-PCR技术克隆了此毒株的所有结构蛋白（S1、S2、M、N）基因，并对 这些基因的序列进行分析。内容包括： 1.将病毒通过9-11日龄鸡胚盲传5-6代，用动物回归和免疫保护试验进行了毒株 的基本特性的研究，用气管环组织培养对病毒进行理化特征测定、毒价测定与中 和试验，初步证明目前流行的以腺胃肿大为主要特征的传染病的病原是冠状病 毒，由于该病引起腺胃的特征性病理变化，所以将该病暂定名为腺胃型传染性支 气管炎，并将该青岛分离株定为SD/97/02株。 2 参考Genbank发表的IBV S1纤突蛋白基因序列，自行设计合成了一对引物， 对传染性支气管炎病毒青岛腺胃分离株（SD/97/02）RNA进行RT-PCR扩增。 产物经琼脂糖凝胶电泳分析，呈现一条1657 bp的条带，将其克隆入pMD18-T 载体中，并进行序列测定，证实为S1基因。将此重组质粒命名为pMDQXS1。该 序列已在Genbank上发表，号码为AF193423。序列分析表明，该每株S1基因 G+C％含量较少，为37.0％，存在Hind Ⅲ，BamHⅠ，BgⅢ，SacⅠ和SalⅠ位点， 无EcoRⅠ位点，与其他毒株的同源性在87.02％-94.21％之间，在第154-429nt处 为高度变异区；将基因序列翻译成氨基酸后，S1蛋白由540个氨基酸组成，等 电点为8.24，在蛋白质内部存在18个Cys，在S1与S2蛋白之间的剪切位点为 HRRRR，这与大多数IBV毒株（RRF/SRR）不一样，有三个区域的氨基酸序列 高度保守：即169-181aa，230-250aa，485-506aa。 3.根据Genbank上发表的IBVS2基因序列，自行设计了两对引物，分别扩增 SD/97/02株S2基因的上游1100bp部分和下游的900bp部分，两段序列拼接后 包含了S2全基因的序列，将此两段分别克隆入pGEM T-easy载体，测序后将序 列用分析软件DNASTAR和网上的BLAST软件进行分析，结果表明，S2基因比 S1基因相对更保守，位于氨基酸第560-600位很可能是与囊膜锚着的部位。 4.参考Genbank上发表的IBV核衣壳蛋白（N）基因序列，自行设计合成了一对 引物，对青岛腺胃株病毒（QXIBV）RNA进行RT-PCR扩增，产物经琼脂糖凝 胶电泳分析，呈现一条1248bp的条带，将其克隆入pGEM T-easy载体中，并用 Pst、Xbal、及Hind Ill对PCR产物进行酶切，然后进行序列测定，证实为N 基因。将此重组质粒命名为pGEMQXNP；序列分析表明，SD／97／02株的N基因 与Genbank上发表的序歹同源性在86－87％左右，在Z192nt，574－656nt， 68 1738nt处的变异最大，氨基酸同源性在89－gi％之间，在3－13aa，209－237aa 处变异较大；对N蛋白氨基酸特性分析表明，在N蛋白内部存在多个磷酸化位 点，且N蛋白具有强亲水性和强抗原性． 5．参考Genbank上的IBV序列，自行设计合成了三条引物，对传染性支气管炎青 岛腺胃分离株（SD／97／02）RNA进行 RT－PCR扩增，扩增含基质蛋白 ＊）及 sa、 sb蛋白的约1．65Kb的基因，对PCR产物进行克隆后测序。序列分析显示，M蛋 白基因与其它IBV相应的基因同源性在90．33％一92．75％之间，对氨基酸序列序 列比较，同源性在89．82％一94．25％之间；sa基因与其它IBV的基因同源性在 84．34％一87．37％之间，氨基酸同源性在8182％左右；sb基因与其它ISV的基因 同源性在引－92％之间，氨基酸同源性在93％左右。