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《南京农业大学》 2002年
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水稻功能基因的电子克隆与盐胁迫诱导cDNA文库的构建

黄骥  
【摘要】: 电子克隆(in silico cloning)是近年来伴随着基因组计划和EST计划发展起来的基因克隆新方法,它的主要原理是利用日益发展的生物信息学技术,借助电子计算机的巨大运算能力,通过EST或基因组的序列组装和拼接,利用RT-PCR的方法快速获得功能基因。相比传统的图位克隆和转座子标签法克隆的方法具有投入低、速度快、技术要求不高和针对性强等优点,同时又克服了mRNA差异显示技术、抑制差减杂交技术不能获得全长基因的缺点。随着人类基因组计划的实施,研究人员利用电子克隆的方法已经克隆了许多人的功能基因。由于受到序列资料的限制,植物领域的电子克隆还鲜有报道。随着水稻基因组研究的不断深入,尤其是2002年初我国水稻基因组序列框架图的公布,使得水稻电子克隆成为可能。 采用电子克隆的方法,以公布的小麦葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)基因的cDNA序列为信息探针,在GenBank的水稻nr数据库中找到了与之高度同源的水稻基因组序列,通过人工序列拼接结合基因组结构预测软件分析得到了1,762bp的水稻G6PDH的cDNA序列,进一步采用RT-PCR的方法分离了水稻G6PDH的cDNA克隆,命名为OsG6PDH;以玉米6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)基因的cDNA序列为信息探针,搜索GenBank的水稻dbEST数据库,通过EST拼接获得了1,771bp的水稻6PGDH的cDNA序列,并通过RT-PCR的方法获得水稻6PGDH的cDNA克隆,命名为Os6PGDH。本研究首次从一个作物中同时克隆了胞质G6PDH基因和6PGDH基因,对进一步研究植物磷酸戊糖途径的亚细胞分布及胞质中磷酸戊糖途径的生理意义都具有十分重要的意义,也为G6PDH+6PGDH的基因工程利用做好了准备。 本研究克隆的OsG6PDH的基因组序列约5 kb,具有15个外显子,5’端上游具有7个可能的启动子,可能性最高的启动子具有典型的TATA-box,该基因完整ORF编码505个氨基酸,分子量57.7 ku,pI=6.49。定量RT-PCR分析表明,OsG6PDH在水稻幼穗、胚、根、叶中都有表达,其中在幼穗和根中的表达略高。克隆的Os6PGDH基因组序列只有3 kb, 包括2个外显子,第1个外显子仅有46 bp,起始密码子出现在第2个外显子中,在基因组序列的5’上游确定了一个Os6PGDH的启动子区域。Os6PGDH完整的ORF编码480个氨基酸,分子量52.7ku,pI=5.85,经定量RT-PCR分析,Os6PGDH在幼穗中的表达显著高于其他组织。 分别对G6PDH和6PGDH进行进化树分析,结果表明:高等植物6PGDH基因 员骤 硕土学位谊文:水稻切能是因的电子兔隆与盐胁迫诱导CDNA文库的构建 可能起源于蓝细菌,而G6PDH的进化关系比较复杂,尚难以断定其起源,但已有的 基因组结构和进化树证据可以证明 G6PDH与 6PGDH的不同来源。 利用一段约500hp的EST序歹11,与GenBank中的水稻dbEST库同源性比较,构 建阴T重叠群,拼接了一个含有QALGGH保守结构的CZHZ型水稻锌指蛋白基因, 通过RT-PCR的方法获得了该CDNA克隆,命名为OsZFP。序列分析表明其完整ORF 编码 171个氨基酸,含有 2个典型的 CZHZ型锌指结构,预测分子量为 17.9 ku, pl<.19。OsZFP是迄今为止在水稻中克隆的第 2个 CZHZ型锌指蛋白基困。 以水稻耐盐品种韭菜青为材料,构建了盐诱导水稻幼苗CDNA文库。该文库包 含了盐诱导不同时期的mRNA集合,经鉴定,所构建的cDNA文库扩增前的原始滴 度在 l.08 XIO’,重组率为 990;平均插入片段大,J、为 l.Ikb,扩增后的文库滴度为 0.SX卜‘。该文库的构建作为当前水稻电子克隆的补充,满足了大片段基困克隆的需 要。 本文克隆的 OsG6PDH、Os6PGDH和 OsZFP基因已经在 GenBank中登陆,登 陆号为:AY078072、AF486280和AY077725。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S511

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【引证文献】
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1 魏跃;甜瓜属Cucumis×hytivus Chen and Kirkbride种间杂交的分子验证和细胞器基因的遗传分析[D];南京农业大学;2009年
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1 李晓晓;大豆维生素生物合成相关酶基因的克隆及对马铃薯的遗传转化[D];首都师范大学;2007年
2 李蕊;大豆维生素B_6合成关键酶基因的克隆及对马铃薯的遗传转化[D];首都师范大学;2007年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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10 黄骥,张红生,曹雅君,王东,王建飞,杨金水;一个新的水稻C2H2型锌指蛋白cDNA的克隆与序列分析[J];南京农业大学学报;2002年02期
【共引文献】
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3 李晓晓;李蕊;李雅轩;蔡民华;胡英考;;日本百脉根■牛儿基■牛儿基氢化酶的电子克隆及进化分析[J];安徽农业科学;2006年23期
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7 田志环;;淹涝胁迫对水稻影响的研究进展[J];安徽农业科学;2008年01期
8 陈卓;刘杰;钱万强;孙杰;沈继红;林学政;王能飞;;表达序列标签(EST)分析及藻类EST文库的研究进展[J];安徽农业科学;2009年05期
9 蒋自立;;植物DNA甲基化与转基因沉默[J];安徽农业科学;2009年12期
10 林元震;张志毅;林善枝;;甜杨葡萄糖-6磷-酸脱氢酶基因的电子克隆及其功能预测[J];安徽农业科学;2009年29期
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1 刘录祥;赵林姝;梁欣欣;郑企成;刘强;王晶;郭会君;赵世荣;陈文华;;基因枪法获得逆境诱导转录因子DREB1A转基因小麦的研究[A];2003年全国作物遗传育种学术研讨会论文集[C];2003年
2 张丽;张洪亮;李自超;;转mtlD基因和BADH基因早稻苗期耐盐性研究[A];2005年全国作物遗传育种学术研讨会暨中国作物学会分子育种分会成立大会论文集(二)[C];2005年
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4 肖祥希;刘星辉;杨宗武;陈立松;;植物铝毒害研究进展[A];中国园艺学会第五届青年学术讨论会论文集[C];2002年
5 曹家树;余小林;叶纨芝;卢钢;向珣;;园艺植物的分子育种[A];全国蔬菜遗传育种学术讨论会论文集[C];2002年
6 史公军;侯喜林;王彦华;;不结球白菜胞质雄性不育系atp6基因cDNA片段的克隆及序列分析[A];蔬菜分子育种研讨会论文集[C];2004年
7 王岩;张宝玺;张延国;张国裕;王立浩;徐有明;王晓武;;辣椒C基因全长序列的获得及同源序列比较[A];中国园艺学会第十届会员代表大会暨学术讨论会论文集[C];2005年
8 徐伟理;李洪艳;梁鹏;许文平;王世平;;光照对葡萄果实着色的影响[A];2008园艺学进展(第八辑)——中国园艺学会第八届青年学术讨论会暨现代园艺论坛论文集[C];2008年
9 胡恭任;于瑞莲;;泉州湾近岸海域水体重金属污染及防治对策研究[A];中国环境保护优秀论文集(2005)(下册)[C];2005年
10 黄骏麒;林栖凤;李冠一;;第三章 植物分子育种的研究与应用[A];植物分子育种——第四届全国植物分子育种学术研讨会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 韩英鹏;多环境、多遗传背景下不同发育时期大豆籽粒重的QTL分析[D];哈尔滨师范大学;2010年
2 孙国清;不同抗虫棉品种杀虫蛋白表达研究及影响抗虫性分析[D];新疆农业大学;2010年
3 韩莹琰;白菜花粉发育相关的C2H2型锌指蛋白新基因BcMF20的克隆与功能验证[D];浙江大学;2011年
4 李薇;一个水稻E3泛素连接酶OsBBI1在水稻对稻瘟菌广谱抗性中的作用研究[D];浙江大学;2010年
5 何影;引入甘氨酸甲基化合成甜菜碱途径提高黑麦草抗旱性研究[D];山东大学;2010年
6 曾兴权;小麦抗条锈病种质的鉴定及其抗性相关基因的差异表达和克隆[D];西北农林科技大学;2010年
7 苏磊;花生种子全长cDNA文库序列分析及花生LEA基因家族的初步研究[D];山东师范大学;2010年
8 王超;紫菜光合碳同化途径相关基因的表达分析[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2011年
9 景峰;滨海泥质盐碱地盐土造林技术研究[D];北京林业大学;2011年
10 郝金凤;无载体无选择标记转基因耐贮藏甜瓜的培育[D];内蒙古大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 高宝峰;汉江中下游铜锈环棱螺重金属分布及生物指示作用[D];华中农业大学;2010年
2 王引;柑橘溃疡病不同抗性类型生理差异比较及SA诱导的抗性研究[D];华中农业大学;2010年
3 朱冬梅;盐碱胁迫下星星草(Puccinellia tenuiflora)根部转录应答的初步分析[D];哈尔滨师范大学;2010年
4 杨光;家蚕BYB基因的表达及其功能分析[D];浙江理工大学;2010年
5 杨洛滨;盐胁迫下5个树种根系活力及Na~+,K~+含量影响的研究[D];山东农业大学;2009年
6 丛倩倩;二穗短柄草的遗传转化及INDETERMINATE1基因的克隆[D];山东农业大学;2010年
7 吕廷良;白蜡等4个树种盐胁迫下生理生化反应的研究[D];山东农业大学;2010年
8 潘海涛;小麦EST-SSR标记的开发和苗期养分吸收QTL定位[D];山东农业大学;2009年
9 汪俊君;小麦大粒突变体的遗传分析和相关基因片段的克隆[D];山东农业大学;2009年
10 谭钺;设施桃低温需求量与需热量关系机制的初步研究[D];山东农业大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 孙琳琳;蒋继志;李丽;;生物信息学及在农作物抗性基因研究中的应用[J];安徽农学通报;2006年10期
2 高俊山,林毅,叶兴国,马传喜;植物转基因技术和方法概述[J];安徽农业科学;2003年05期
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中国博士学位论文全文数据库 前8条
1 王树彦;加拿大披碱草与老芒麦种间杂种F_1代的育性恢复研究[D];内蒙古农业大学;2004年
2 杨红花;李、杏属间远缘杂交及种质创新的研究[D];山东农业大学;2004年
3 陈大福;蜜蜂(Apis mellifera)ant基因和vha16基因的克隆及其功能预测的生物信息学研究[D];浙江大学;2004年
4 胡德昌;柿及其部分近缘种mtDNA和cpDNA多态性分析[D];华中农业大学;2007年
5 徐传远;油菜与诸葛菜远缘杂交后代的选育及遗传分析[D];华中农业大学;2007年
6 杨寅桂;黄瓜耐热性及热胁迫响应基因研究[D];南京农业大学;2007年
7 王晓敏;葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在芦苇愈伤组织盐适应性中调节作用的机理研究[D];兰州大学;2008年
8 杜雪竹;甘蓝型油菜与Lesquerella fendleri及菘蓝族间杂种的遗传研究[D];华中农业大学;2008年
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1 张艳贞;利用转基因技术将Bt杀虫蛋白基因导入优良玉米自交系的研究[D];中国人民解放军军需大学;2002年
2 苏俊峰;Bt抗虫基因导入马铃薯的遗传转化研究[D];东北农业大学;2004年
3 侯夫云;水稻戊糖磷酸途径两个关键酶基因的克隆与功能分析[D];南京农业大学;2005年
4 丁林云;水稻胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的功能分析[D];南京农业大学;2007年
【二级引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 孙翠;核桃(Juglans regia L.)坚果仁维生素E含量分析及jrMPBQ基因克隆[D];山东农业大学;2010年
2 林静;蜡梅脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆与功能初步分析[D];西南大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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2 韩建国,毛培胜,浦心春,李敏;草坪型高羊茅种子活力的研究[J];草地学报;1995年04期
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8 郭岩,张莉,肖岗,曹守云,谷冬梅,田文忠,陈受宜;甜菜碱醛脱氢酶基因在水稻中的表达及转基因植株的耐盐性研究[J];中国科学C辑:生命科学;1997年02期
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10 茅弼华,王荫传,陆仁峥,肖跃成,张存銮,姜开圣;受淹水稻的生育特点及其培管技术[J];江苏农业科学;1992年03期
【相似文献】
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2 罗彦长;王守海;;分子标记辅助水稻抗病虫育种进展[A];现代农业理论与实践——安徽现代农业博士科技论坛论文集[C];2007年
3 徐绮霞;孙洋;张永军;吴孔明;郭予元;;水稻萜烯合成酶基因Os08g07100的鉴定及序列分析[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
4 邱德文;;蛋白质农药研究与产业化进展[A];第四届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会暨第三届生物农药研讨会论文集[C];2006年
5 沈辉;王宗阳;;水稻OsEBP89基因启动子的功能分析[A];中国植物生理学会全国学术年会暨成立40周年庆祝大会学术论文摘要汇编[C];2003年
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9 关舒;印遇龙;黄瑞林;T.Zhou;;镰孢霉菌的侵染规律、霉菌毒素形成过程及调控技术[A];饲料营养研究进展(2010)[C];2010年
10 杨兴露;许红亮;李文慧;晏月明;胡英考;;综合应用在线生物信息筛选小麦种子发育特异表达基因[A];中国作物学会50周年庆祝会暨2011年学术年会论文集[C];2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
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2 记者 韩晓玲 实习生 华子博 通讯员 农宣;华中农大水稻团队发现重要基因[N];湖北日报;2010年
3 冯耀华 詹曙光;野生水稻基因丰富优良 专家建议加强保护[N];粮油市场报;2011年
4 记者 李斌;破译水稻基因追踪[N];新华每日电讯;2002年
5 张洪 王如君;水稻基因是人的两倍[N];农民日报;2002年
6 吴林寰;我国完成400多个水稻基因转基因克隆工作[N];粮油市场报;2010年
7 记者 李斌;逐鹿水稻基因研究[N];新华每日电讯;2002年
8 ;日本破译3.2万个水稻基因[N];今日信息报;2003年
9 通讯员 娄沂春 记者 马瑛瑛;浙大成功开发大容量水稻基因芯片[N];浙江日报;2001年
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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9 孙田田;水稻茎端分生组织离体重建过程中生长素和细胞分裂素响应信号的分布模式研究[D];山东农业大学;2012年
10 唐海娟;根癌农杆菌介导的水稻转基因体系研究[D];南京农业大学;2009年
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