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《南京农业大学》 2002年
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伪狂犬病病毒上海株gE~-/gI~-/GFP~+/LacZ~+缺失株的构建及其免疫原性初步研究

姜焱  
【摘要】: 伪狂犬病(Pseudorabies)又称Aujeszky氏病,是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒I(suidherpesvirus Ⅰ)所引起的猪、牛、羊等多种家畜及野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)、脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。猪是该病的主要贮存宿主和传染源,对养猪业造成的经济损失仅次于猪瘟和口蹄疫。灭活苗和弱毒苗的使用对防制本病起到了一定的作用,但存在一些缺点。随着分子生物学技术的发展,已先后有多株基因缺失苗问世,并在该病的预防免疫及根除中起到决定性作用。欧、美一些发达国家已明确规定:只能使用伪狂犬病gE基因缺失疫苗对猪进行伪狂犬病预防免疫。有许多国家利用该方法及相应监测方法根除了本病。 伪狂犬病病毒上海株(PRV-SH)是从上海地区某猪场发病猪中分离的一株地方毒株,它在PK15细胞上形成的蚀斑小而不规则,TCID_(50)为10~(-6.68)/0.1ml,接种家兔和哺乳仔猪后均出现典型的伪狂犬病症状,与强毒株Ea株具有相似的特性,据此推测,PRV-SH株为强毒株。经过对PRV-SH株gE和gI基因序列分析发现,PRV-SH株gE基因和gI基因与我国的地方分离株Ea株和Fa株的基因同源性及推导的氨基酸同源性都很高,所以选择PRV-SH株为亲本毒株来构建基因缺失疫苗,在我国具有一定的实用价值。 gE基因是PRV的一个重要的毒力基因,在PRV向神经系统的扩散中起重要作用。研究发现,只要缺失掉gE 5’端第125位的缬氨酸和第126位的半胱氨酸,PRV毒力就会大大降低且不影响其免疫原性。gI基因也是决定PRV毒力的一个参考基因,它与gE基因以非共价键的形式结合成gE/gI复合体而发挥功能。完全缺失gE、gI的弱毒株免疫的猪,不能抵抗对强毒的攻击,且gI是诱导完全保护所必须的。gE糖蛋白的N端33位到100位的氨基酸区段包含了主要抗原表位,缺失掉该段基因,在机体内就不能产生相应的抗体,这为区别野毒感染和疫苗接种提供了依据。 绿色荧光蛋白(GFP)是来源于水母体内的一种蛋白,大小为238个氨基酸。后来经过基因突变改造为EGFP,其荧光强度比野生的GFP强45倍。它是用于各种生物体及细胞系的一种理想的生物标记蛋白。它具有检测方便,荧光稳定及对生活的细胞无毒害等优点。 姜颖:伪狂大刑&毒卜海株gE/gi”/GFP“/LacZ+缺失株的构建及其免疫原仲初步研究 本研究用 PCR方法扩增了伪狂犬病病毒上海分离株的 gE基困和部分 gi基困,然 后用酶切方法缺失掉 gE基因 5’端的毒力部分,保留了部分 gi基因和部分的 gE基因, 并在此位置插入了GFP和lacZ两种筛选基因,构建了PRV{H株的缺失转移载体 ggEI《FPZ。用D叮外转染后,首先用蓝斑对重组病毒进行筛选,然后用肝 进一步 筛选,获得了重组病毒。通过对小鼠和家兔接种试验,结果表明构建的重组病毒的毒 力比亲本毒PRV亿 的毒力有所下降,重组病毒在RK细胞上生长良好,接种断奶仔猪 后,无不良反应。现将主要的研究内容概述如下: 根据已发表的伪狂犬病病毒gE和J基困的序列,利用primer软件设计了两对 引物,用PCR方法扩增了伪狂犬病病毒上海分离株的gE和J基因,并将其克隆到 pGEMT-Easy载体中。通过测序,PRV-SH的gE和旷基因大小分别为二734b和961hp。 gE基因与发表的PRV斗a株,Rice株Ea株的同源性分别为97.5%、98.6%、97.9%,推 断的氨基酸的同源性为94.6儿97.l人95.7人PRV七H株的gi基因与叩VAice株、 PRV-Fa株sl基困核旮酸的同源性分别为94.7%和95.8%;推导的氨基酸的同源性分别 为91.3%和92%。这进一步证实了所扩增的基因就是PRV-洲的昨和gi基因。通过分 析发现,gE和钉糖蛋白属于典型的 1型膜蛋白结构,且J糖蛋白具有很强的抗原性。 在伪狂犬病病毒上海株J基因和gE基因克隆鉴定的基础上,将gi和gE基因克 隆入PUC18中,构建了PPEI载体。利用gE基因中的酶切位点缺失掉PE基因5’端363hP, 并把绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒插入到缺失部分,通过酶切鉴定,表明GFP基 因已插入到PgEI中,构建了含盯P的缺失转移载体阳B卜0卯。然后在盯P基因表达 盒的多克隆位点插入 LacZ基因阅读框,构建了含双报告基因的 PRV-SH转移载体 ggE卜GFP乙此载体为改造卯v《H株及开发二价或多价基因工程疫苗提供了有力工具。 用DOTAP 转染试剂盒将ggE卜GFPZ车染感染了叩V-洲的B肌-21圭月,待出现so%病 变后收获病毒,并以蚀斑法得到纯化的含 LacZ和 GFP两种筛选标记的缺失了 sE儿 基因的重组病毒株,命名为rmPRV。 经过对rmPRV的生物学特性及其免疫原性进行了初步研究,结果显示,该疫苗株 能在眈细胞上适应生长并形成典型蚀斑,与亲本病毒比较,其在叫细胞上的毒价相 刁,m仁* 株和rm叩V株nm;。分别为1*’/.lml和10”’/0.lml。这表明缺失批 和gi基困对叩V在M细胞的生长影响不大。PRV-SH和rmPRV对,J、鼠的半数致死量分 别为 5.5和 3.68,结果表明卯V-SH tb rmPRV高。在对家兔的实验中,接种相同的病 毒量,PRV6H在接种后具有典型的奇痒症状,且在接种后 36,]、时死亡,6 rmPRV接 种后 8天左右死亡。这些结果表明
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S852.65

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【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前2条
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【参考文献】
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【共引文献】
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2 庄金秋;梅建国;沈志强;;犬瘟热病毒实验室检测方法研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
3 蒋再学;陈征兵;林文;余邵华;竺薇;张晓明;罗满林;;仔猪伪狂犬PCR鉴定及病毒分离[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
4 陈宗艳;朱英奇;李传峰;李露;付玉志;王超;刘光清;;新发鸭源呼肠孤病毒(TH11株)的分离与鉴定[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
5 王珊;刘冰;李德朋;孙远;马勇;田秀丽;宋宇;王承宇;张乃生;;马蹄香治疗犬细小病毒性肠炎的疗效观察[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会第七届代表大会暨学术研讨会论文集(下册)[C];2011年
6 程晶;荫硕焱;盖新娜;郭鑫;杨汉春;;2006—2008年我国部分地区规模化猪场PRV血清流行病学调查[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
7 赵东升;盖新娜;孙栋;郭鑫;杨汉春;;猪脑心肌炎灭活疫苗的制备及小鼠免疫研究[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
8 王春花;成军;郎振为;吴煜;杨艳杰;张黎颖;刘妍;;基因表达谱芯片技术筛选XTP3蛋白反式调节基因[A];第一届全国人工肝及血液净化学术年会暨全国人工肝及血液净化攻关协作组成立大会论文集[C];2004年
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10 方忠意;崔保安;;动物基因工程疫苗研究进展[A];新型疫苗研发及基因工程疫苗应用研讨会论文集[C];2010年
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1 邱洁;人类肥胖相关新基因LYRM1的生物学特性及功能研究[D];南京医科大学;2009年
2 赵冬敏;B亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性[D];山东农业大学;2010年
3 赵鹏;猪繁殖与呼吸综合征病毒在抗体选择压下的变异[D];山东农业大学;2010年
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5 张青婵;A亚群禽白血病病毒不同分离株的基因组和生物学特性比较[D];山东农业大学;2010年
6 宋翠平;H5N1禽流感和鹅Ⅰ型副粘病毒分离株的生物学特性及感染性的研究[D];中国海洋大学;2010年
7 黄馨;端粒缩短影响原发性高血压及其并发症的发生[D];北京协和医学院;2010年
8 张琪;KLT对中脑神经系统疾病的影响及KLT、NDV、SW联合抗肿瘤作用机制研究[D];西北农林科技大学;2010年
9 张文娟;禽用复合维生素纳米乳的研制及其功效评价[D];西北农林科技大学;2010年
10 熊义;IRES调控α-干扰素的抗FMDV研究[D];武汉大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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2 李爽;鸭源禽呼肠孤病毒感染雏鸭的免疫病理学研究[D];华中农业大学;2010年
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4 徐珊珊;重组杆状病毒介导的高致病性猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗研究[D];华中农业大学;2010年
5 龚文芳;棉花抗细胞凋亡基因GhDAD1的克隆、定位及表达分析[D];华中农业大学;2010年
6 胡智斌;湖北省高致病性猪蓝耳病活疫苗(JXA1-R株)试用报告[D];华中农业大学;2010年
7 许莹;H3N8型马流感血凝素核酸疫苗的初步研究[D];南京医科大学;2010年
8 邬成业;禽流感病毒H5N1亚型河南分离株NP基因的原核表达及T细胞表位筛选[D];郑州大学;2010年
9 史平玲;猪FcγRⅢ介导PRRSV抗体依赖增强作用研究[D];郑州大学;2010年
10 巩艳艳;抗体免疫选择压作用下新城疫病毒HN基因和F基因的变异[D];山东农业大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前6条
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中国硕士学位论文全文数据库 前3条
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【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前2条
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中国硕士学位论文全文数据库 前4条
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【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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6 马相如;伪狂犬病病毒宿主关闭蛋白的基因克隆、表达及其结构分析[D];华中农业大学;2004年
7 覃广胜;伪狂犬病病毒广西B、W株gE基因的扩增、克隆及序列分析[D];广西大学;2002年
8 赵世广;分泌抗伪狂犬病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步应用[D];河南农业大学;2002年
9 徐引弟;伪狂犬病病毒鄂A株BamHI5'片段gK、UL54、ORF-1基因的克隆与表达[D];华中农业大学;2001年
10 陈磊;伪狂犬病病毒新疆株的分离鉴定及其gD和gE基因的克隆与序列分析[D];新疆农业大学;2004年
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