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《南京农业大学》 2003年
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华东地区猪圆环病毒2型的分子流行病学调查及其感染性核酸的构建

芦银华  
【摘要】: 1、在全面分析猪圆环病毒(PCV)两种血清型基因组差异的基础上,设计合成引物,建立了用于PCV1与PCV2检测分型的复合PCR方法。应用该方法对5株猪源细胞系及127份患呼吸道疾病的断奶仔猪病料进行了PCV检测。结果显示,5株细胞都可扩增出PCV1的基因片段,其中1株PK-15细胞还扩增得到了PCV2的DNA片段;上海、江苏、山东及浙江四个省市患呼吸道疾病的猪群中普遍存在PCV感染,其中PCV2感染最为普遍,感染率分别为27.3%(3/11)、15%(3/20)、23.1%(6/26)及48.1%(13/27);其次是PCV两种血清型的混合感染,四省市的感染率分别达18.1%(2/11)、20%(4/20)、7.7%(2/26)及19.2%(5/27),患呼吸道疾病的猪群中也存在一定比例的PCV1感染。 2、根据Genbank中发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪细小病毒(PPV)基因序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PPV的RT-PCR及PCR方法。应用建立的方法对38个PCV2阳性病科进行了PRRSV及PPV检测,以确定猪群中PCV2与PRRSV和/或PPV混合感染情况。结果表明,15份样品表现为PRRSV与PCV2混合感染,占样品总数的39.4%;2份样品表现为PCV2与PPV混合感染,占5.3%。另外,还存在一定比例的三重感染,共3个样品,占7.9%。由此可见,猪群中PCV2与PRRSV及PPV混合感染比较普遍。 3、将5份经复合PCR检测为PCV2阳性的病料分别接种无PCV1污染的PK-15细胞,盲传4代,分别用PCR、间接免疫荧光试验(IFA)及超薄切片电镜观察鉴定PK-15上PCV2病毒增殖情况。结果表明,从5株PK-15细胞中均扩增出了1154bp的PCV2特异条带;IFA试验显示细胞核中含有大量的病毒抗原;在电镜下可见到典型的PCV2病毒颗粒,直径约为17~20nm。将分离的5株PCV2分别命名为JiangsuPCV、ShanghaiPCV、Zhejiang1PCV、Zhejiang2PCV及ShandongPCV,并测定了各毒株的TCID_(50)。以分离的PCV2病毒作为抗原建立了用于检测PCV抗体的IFA方法。应用该方法对临床送检的133份血清样品进行PCV抗体检测,结果显示,PCV抗体阳性率达58.9%。 4、根据Genbank中发表的PCV2毒株的全基因组序列,设计一对特异性引物,用PCR方法扩增出5个PCV2分离毒株的全基因组。将扩增片段克隆于pcDNA3载体的EcoRI酶切位点,经氨苄青霉素(Amp)抗性筛选及EcoRI酶切鉴定,获得5个含有不同PCV2全基因组的阳性重组质粒,分别命名为pcDNAJSpcv、pcDNASHpcv、 芦银华:华东地区猪圆环病毒2型的分子流行病学调查及其感染性核酸的构建 peDNAZJlpev、peDNA刀Zpev及peDNAsDPcv。对质拉中的插入片段进行序列测定表 明,5个全基因组扩增片段均长1 768bP,与资料报道相符。应用DNAstar序列分析软 件,对测定的5个PCVZ分离株序列与Genbank中的国内外PCV毒株进行同源性比较 并绘制系统发生树,结果表明本实验的5个PCVZ毒株与世界上其它地区的PCVZ分 离株密切相关,核普酸序列同源性为94.5%一100%,与PCVI毒株的序列同源性只有 69.7%一71.1%。另外,不同PCvZ毒株之间基因组序列相对比较保守,但来源于不同地 区的PCVZ分离株基因组序列存在明显差异。系统发生进化树显示,本实验中的 shanghaipcv、zhejianglPCv、JiangsupCv三个毒株与一美国毒株AfZ尔旧39亲缘关系 较近,shandongPCv与劝句langZpCv与一德国分离株AF201311有较密切的亲缘关系。 5、通过两种方法构建了猪圆环病毒2型的感染性核酸。1)、将已构建的含单拷 贝PCVZ全基因组的重组质拉peDNA讲v用石七口RI酶切,获得PcvZ全基因绷1 768bP) 的双链形式,在体外用T4 DNA连接酶连接环化;2、用石七口RI对peDNApev质粒进行 不完全酶切,获得含有PCVZ全基因组单拷贝的线性载体,去磷酸化后与另一个PCVZ 全基因组拷贝连接,转化DH5a感受态细胞,通过氛千青霉素(AmP)杭性筛选及EcoRJ 酶切鉴定,获得含有双拷贝的重组质拉peDNAd伴v。对质拉中序列进行浏定,发现2 个拷贝的全基因组一前一后同一方向排列。用脂质体法将双链PCVZ全基因组体外环 化产物、重组质粒peDNA伴v及peDNAdPcv分别转染无PCv污染的PK一巧细胞,4 次连续传代后,用PcR、间接免疫荧光试验(开汽)及超薄切片电镜观察,发现转染体 外环化产物及peDNAdpcv的细胞中存在具复制能力的PCvZ病毒,而转染重组质拉 peDNA伴v的细胞未检测到病毒的产生。将转染后获得的病毒感染PK一巧细胞,用正叭 进行检测,可以见到细胞核内存在大量的病毒抗原。由此可见,本试验构建的环化的 双链PCvZ全基因组及含有双拷贝基因组的重组质粒peDNAd拌v具有感染性,从而为 进行PCVZ致病性及致病机理研究打下了基础。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S855.3

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 李文杰;猪圆环病毒2型分子流行病学调查[D];扬州大学;2006年
2 王建龙;猪圆环病毒2型ORF2基因重组质粒的制备及其对小鼠的免疫效应[D];西北农林科技大学;2007年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 郎洪武,王力,张广川,程君生,宋立;猪圆环病毒分离鉴定及猪断奶多系统衰弱综合征的诊断[J];中国兽医科技;2001年03期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 ;An Immunochromatographic Strip Test for Rapid Detection of Antibodies against Porcine Circovirus Type 2[J];Animal Husbandry and Feed Science;2011年05期
2 陈桂香;郭其祯;银梅;王玲恩;任静强;;猪呼吸道疾病(PRDC)的综合防治[J];安徽农业科学;2006年24期
3 郝贵增;靳玉芬;;猪圆环病毒的分子生物学研究进展[J];安徽农业科学;2007年13期
4 陈杨;徐志文;郭万柱;陈弟诗;;猪圆环病毒2型的致病机理和疫苗研究进展[J];安徽农业科学;2007年18期
5 王宪文;谢青梅;曹永长;于康震;毕英佐;;PCV2·ORF2基因片段在大肠杆菌中的表达与纯化[J];安徽农业科学;2007年23期
6 王岩;王新卫;侯春彬;张春霞;李文刚;;猪圆环病毒Ⅱ型ZZ株ORF2基因的扩增、测序与序列分析[J];安徽农业科学;2007年27期
7 易道生;娄高明;韩先干;冯顺胜;;猪圆环病毒多重PCR检测与分型[J];安徽农业科学;2007年32期
8 白静;梁月丽;;猪圆环病毒河南株的分离与鉴定[J];安徽农业科学;2008年13期
9 高超;肖冲;高瑞峰;胡桂学;;猪圆环病毒2型ORF2基因原核表达蛋白间接ELISA检测方法的建立[J];安徽农业科学;2010年32期
10 芦银华,华修国,陈德胜,黄伟坚,戴亚斌,谈国蕾,陈溥言;猪圆环病毒2型分离毒株全基因组的克隆及序列分析[J];病毒学报;2003年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 梁鹏帅;蔡汝健;刘燕玲;孙瑞芹;张龙现;宋长绪;;华南地区猪圆环病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒检测分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
2 翟少伦;陈胜男;张建武;韦祖樟;龙进学;袁世山;魏文康;陈琴苓;宣华;吴大成;;猪圆环病毒感染人类的可能途经剖析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
3 曾思遥;张淑琼;余绍华;唐志玲;陈瑞爱;罗满林;;TaqMan实时荧光定量PCR检测PCV2方法的建立[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
4 王贵华;陈义锋;张工;刘明明;赵亚荣;;猪圆环病毒2型毒株分离鉴定[A];新型疫苗研发及基因工程疫苗应用研讨会论文集[C];2010年
5 李曦;符芳;王靖飞;崔尚金;童光志;;断乳仔猪多系统衰竭综合征的病原学调查[A];2005辽宁省畜牧兽医学会养猪研究会学术年会论文集[C];2005年
6 陈珍;施少华;杨维星;傅光华;陈红梅;程龙飞;林芳;林建生;黄瑜;;鸭圆环病毒感染流行病学的初步调查[A];2008年福建省科协第八届学术年会农业分会场论文集[C];2008年
7 朱凤霞;;猪圆环病毒的分子生物学研究进展[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
8 王宪文;姚四新;张智勇;刘兴友;;河南省猪圆环病毒流行情况初步调查与分析[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
9 董发明;王天奇;邱妍;潘耀谦;龙塔;郭含;;断奶仔猪多系统衰竭综合征肺肝肾等器官病理组织学研究[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
10 王宪文;王岩;刘兴友;杨崇欣;;PCV2河南株的分离和基因进化分析[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王礞礞;猪源TTV:分子流行病学,全长序列分析及感染性分子克隆的构建[D];中国农业科学院;2011年
2 尹双辉;猪圆环病毒2型衣壳蛋白病毒样颗粒的制备及其免疫原性的研究[D];中国农业科学院;2011年
3 陈杨;PPV和PCV2核酸疫苗及PRV-PPV-PCV2基因工程疫苗的研究[D];四川农业大学;2011年
4 邢福珊;PCV-2 ORF2蛋白在杆状病毒表面的展示及动物免疫试验[D];西北农林科技大学;2011年
5 李文良;中国东部PCV2分子流行病学与PCVD亚单位疫苗抗原分子研究[D];南京农业大学;2011年
6 刘翠权;广西395个规模猪场猪呼吸道疾病综合征的病原学调查及防控措施[D];南京农业大学;2011年
7 李俊;猪圆环病毒2型遗传演化及含CpG基序的核酸疫苗研制[D];山东师范大学;2012年
8 刘岳龙;鸡贫血病毒中国株基因序列比较、病毒编码蛋白的表达及分子克隆化病毒的构建[D];扬州大学;2001年
9 王忠田;猪圆环病毒2型ORF2基因表达及重组蛋白ELISA方法的建立[D];中国农业大学;2003年
10 杜娟;SEN病毒分子病毒学和流行病学研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 宋飞;猪圆环病毒2型(WH株)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒混合感染致病性的研究[D];华中农业大学;2010年
2 张敏;猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞的蛋白质组学研究[D];华中农业大学;2010年
3 张玉丹;猪圆环病毒2型(WH株)灭活疫苗效力的研究——PCV2在肠、肾的分布变化[D];华中农业大学;2010年
4 逄莎莎;PCV2人工感染对仔猪免疫器官的影响以及PCV2-WH株灭活疫苗的保护作用研究[D];华中农业大学;2010年
5 张厚勇;猪戊型肝炎病毒的分子流行病学调查及ORF2区的克隆和表达[D];华中农业大学;2010年
6 祁艳华;猪圆环病毒2型ELISA抗体检测方法的建立及PCV2单克隆抗体的制备[D];郑州大学;2010年
7 刘宗争;PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的表达及与PCV2灭活抗原免疫效果的比较[D];山东农业大学;2010年
8 苏金存;猪圆环病毒2型油乳剂灭活疫苗及其免疫效力研究[D];安徽农业大学;2010年
9 李超;安徽地区猪圆环病毒2型的流行病学调查及地方株的特性研究[D];安徽农业大学;2010年
10 王建立;猪圆环病毒2型感染对猪肺泡巨噬细胞模式识别受体转录水平的影响[D];中国农业科学院;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王忠田,杨汉春,吕艳丽;猪圆环病毒II型ORF2基因的克隆及序列分析[J];动物医学进展;2003年01期
2 权忠会,李浩波,李广,刘建军,刘慧;断奶猪多系统衰弱综合征[J];中国畜牧兽医;2003年01期
3 张庆林,宋京,吴祖泽;基因治疗用质粒DNA大规模制备及质量控制[J];国外医学.药学分册;1999年06期
4 褚晓红;碱裂解法小量制备质粒DNA应注意的问题[J];湖北农业科学;2002年02期
5 沈悦斐;薛雅蓉;郑冠群;;CpG DNA对猪免疫增强作用的研究现状[J];家畜生态学报;2006年06期
6 周红,刘玮;CpG序列的免疫激活机理及应用[J];四川生理科学杂志;2005年04期
7 金宁一,秦晓冰,郑敏,鲁会军,张洪勇,尹革芬,葛淑敏;猪2型圆环病毒核酸疫苗的接种Balb/c小鼠实验免疫研究[J];中国生物工程杂志;2005年07期
8 李学伍,杨艳艳,阎玉河,张改平,李青梅,邓瑞广,郭成留,郭军庆,王爱萍,王均;离子交换树脂法与酚仿法对质粒DNA提取效果的比较[J];生物技术;1999年01期
9 王友如,崔洪志,郭三堆;农杆菌质粒DNA提取方法的优化[J];生物技术;2005年04期
10 韩志勇,沈革志,潘建伟;一种改良的质粒DNA小量提取法[J];生物技术通报;2000年04期
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 彭长凌;猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备与初步应用[D];扬州大学;2004年
2 施旅娟;PCV-2感染仔猪的病理学变化及淋巴结细胞凋亡的研究[D];南京农业大学;2006年
【二级参考文献】
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1 郎洪武,张广川,吴发权,张创贵;断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测[J];中国兽医科技;2000年03期
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3 刘文斌,张敬友,李建,高逢结,顾炳泉,全艳平,崔尚金;猪圆环病毒多重PCR检测方法的建立[J];检验检疫科学;2004年05期
4 户瑞刚;;猪圆环病毒与链球菌病混合感染的诊治[J];当代畜牧;2010年10期
5 韩凌霞,童光志;猪圆环病毒的研究进展[J];畜牧兽医科技信息;2002年02期
6 李清艳;翟向和;王谦;;猪圆环病毒与断乳仔猪多系统衰竭综合征[J];今日畜牧兽医;2006年01期
7 崔尚金;全滟平;李曦;符芳;姜艳玲;张莉;;猪圆环病毒多重PCR诊断方法的建立[J];中国预防兽医学报;2006年05期
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10 ;猪圆环病毒疫苗研制成功 全国每年可节约费用30亿元[J];黑龙江畜牧兽医;2010年22期
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2 王鑫;叶贺佳;李敏;仇微红;孙招金;梁昭平;;猪圆环病毒研究进展[A];中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2010年学术年会(第三届中国兽药大会学术论坛)论文集[C];2010年
3 黄立平;刘长明;;猪圆环病毒2型感染引起相关疾病诊断技术的研究进展[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C];2010年
4 万遂如;;猪圆环病毒感染[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(上)[C];2003年
5 翟少伦;陈胜男;张建武;韦祖樟;龙进学;袁世山;魏文康;陈琴苓;宣华;吴大成;;猪圆环病毒感染人类的可能途经剖析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
6 池贤凤;王文秀;沈志强;;猪圆环病毒检测技术的研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
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10 吴德铭;曹永长;毕英佐;;猪圆环病毒研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(上)[C];2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 张晓鹏 记者 李丽云;国内首创“猪圆环病毒新一代疫苗”研制成功[N];科技日报;2010年
2 记者 乔地 通讯员 闻亚丽;“猪圆环病毒”疫苗批准上市[N];科技日报;2010年
3 张晓鹏;“猪圆环病毒疫苗”全国推广[N];农民日报;2010年
4 张晓鹏 记者 彭溢;“猪圆环病毒疫苗” 在哈兽研研制成功[N];黑龙江日报;2010年
5 沙河市动物医院 付丽伟;一例猪圆环病毒和副嗜血杆菌混感的诊治[N];河北科技报;2009年
6 李凯年 译;日本韩国发现猪圆环病毒感染[N];中国畜牧水产报;2001年
7 本报记者 乔地 通讯员 马焱 郑世孝;科技创新,走在富民强国的路上[N];科技日报;2010年
8 中国畜牧兽医学会动物传染病学分会 万遂如;猪圆环病毒2型感染的综合防控技术[N];中国畜牧兽医报;2009年
9 记者 尹江勇;“猪圆环病毒疫苗”技术实现国产化[N];河南日报;2010年
10 晁豪;猪“红斑病”的防治[N];中国畜牧兽医报;2008年
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1 金前跃;猪圆环病毒-Ⅱ型抗体检测免疫层析试纸的研制及单克隆抗体的筛选与鉴定[D];河南农业大学;2012年
2 程爽;泛素蛋白酶体途径在猪圆环病毒2型体外感染中的作用研究[D];华中农业大学;2014年
3 郎洪武;猪圆环病毒2型Cap蛋白的家蚕表达及亚单位疫苗在小鼠和仔猪的免疫效力试验[D];中国农业大学;2013年
4 杨博超;猪圆环病毒2型的Cap蛋白表达、单克隆抗体制备及病毒体外感染单核源细胞的研究[D];中国农业科学院;2012年
5 朱善元;江苏部分地区猪圆环病毒2型的检测及其免疫接种试验[D];南京农业大学;2008年
6 刘建波;猪细环病毒与猪圆环病毒2型分子生物学特性研究[D];中国农业科学院;2014年
7 朱炳林;猪圆环病毒2型感染诱导PK-15细胞自噬机制研究[D];浙江大学;2012年
8 朱玲;猪圆环病毒Ⅰ型、Ⅱ型全基因克隆及其基因交换重组的研究[D];四川农业大学;2005年
9 曹胜波;猪圆环病毒感染性分子克隆构建及siRNA对rep基因表达抑制研究[D];华中农业大学;2005年
10 张兴晓;鸭圆环病毒的分子流行病学调查及诊断方法的建立[D];山东农业大学;2009年
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1 王克宁;抗猪圆环病毒药物体外筛选研究[D];河北农业大学;2012年
2 张敏;猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞的蛋白质组学研究[D];华中农业大学;2010年
3 鲍伟华;猪圆环病毒感染的流行病学调查与控制[D];浙江大学;2007年
4 万青山;四川部分地区猪圆环病毒2型流行病学调查研究[D];四川农业大学;2013年
5 汤智慧;猪圆环病毒2型的分离鉴定及增殖特性的研究[D];西北农林科技大学;2011年
6 孙贤;猪圆环病毒2型的流行病学调查与综合防控措施研究[D];南京农业大学;2012年
7 于淼;猪圆环病毒临床诊断及对单核巨噬细胞系统的影响[D];东北农业大学;2014年
8 张燕;安阳地区猪圆环病毒2型流行病学调查、自家灭活苗的研制及应用[D];河南农业大学;2009年
9 张茜茜;猪圆环病毒2型:流行毒株基因组序列分析及其对Toll样受体传导通路的影响[D];浙江大学;2010年
10 何锡忠;猪圆环病毒2型高密度培养的研究[D];南京农业大学;2009年
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