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《南京农业大学》 2003年
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囊素对杂交瘤细胞增殖和抗体分泌的影响及其信号通路

缪德年  
【摘要】: 囊素是从鸡法氏囊中分离出来的一种三肽,对机体抗体的生成具有极其重要的作用。现有研究表明,囊素不仅可诱导前B淋巴细胞的分化、增殖,而且参与免疫球蛋白的类型转换,但迄今未弄清囊素实现其功能的信号转导通路。为进一步阐明囊素对抗体生成的调节作用及其机制,本文以分泌抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞E8株为模型,进行了囊素对杂交瘤细胞增殖和抗体分泌与表达的影响及相关信号传导通路的初步研究。实验结果如下: 1、囊素对杂交瘤细胞增殖和抗体分泌的影响。用MTT法和定量ELISA法研究表明,囊素不影响杂交瘤细胞的增殖,而具有时间和浓度依赖性的诱导杂交瘤细胞抗体的分泌。加入50μg/mL囊素后2~3h,试验组抗体生成速度大约为对照组的3.7倍,效果显著。说明囊素能提高杂交瘤细胞抗体分泌的速度,而不影响其增殖。 2、囊素对杂交瘤细胞抗体mRNA表达的影响。用ELISA法鉴定杂交瘤细胞E8株分泌的单克隆抗体为IgG_1。据此所克隆的IgG_1重链γ_1恒定区C_H3片段与GenBank中源序列的同源性达99.1%,由其推导的氨基酸序列的同源性为98.2%。在此基础上,用定量RT-PCR技术证明囊素诱导杂交瘤细胞抗体mRNA表达的作用具有时间和剂量依赖性,50μg/mL囊素处理60min,γ_1 mRNA的表达出现高峰。证明囊素能在转录水平上上调杂交瘤细胞单克隆抗体基因的表达。 3、信号转导抑制剂对囊素刺激杂交瘤细胞抗体分泌及其mRNA表达的影响。蛋白激酶A(PKA)抑制剂4-Cyano-3-M-thylisoquinoline、酪氨酸蛋白激酶(TPK)抑制剂Genistein和丝裂原活化的蛋白激酶激酶(MAPKK)抑制剂PD98059能有效地阻断囊素诱导的杂交瘤细胞抗体分泌和表达的增加。这三种蛋白激酶抑制剂对囊素促杂交瘤细胞抗体分泌的抑制率分别为74.55%、91.13%和80.69%。表明囊素诱导的杂交瘤细胞抗体表达和分泌的增加是通过激活该细胞的PKA、TPK和MAPKK,进而通过其后相应的信号传导通路激活有关的转录因子实现的。 4、囊素对杂交瘤细胞PKA活性的影响。50μg/mL囊素能引起杂交瘤细胞中PKA 绥德年:囊素对杂交瘤细胞增殖和抗体分泌的影响及其信号通路 活性显著升高,Zmin达峰值,10min RF恢复到基础水平。Genistein和 PD98059不能抑 制囊素诱导的杂交瘤细胞PKA的活化。说明在囊素刺激杂交瘤细胞抗体分泌的信号 通路中,PKA所涉及的信号通路独主于WK和 MAPKK所涉及的信号通路,或者 PKA 位于这两个激酶的上游并与之构成一个完整的信号通路。 5、囊素对杂交瘤细胞膜性酪氨酸蛋白激酶(m-TPK)if。&的影响。hK一般有受 体型TPK(RT)和非受体型TPK两种,RTK为跨膜型的。用超速离。G法制备杂交瘤 细胞m1PK酶液,并测定其活性。结果表明 50pg/mL囊素能引起杂交瘤细胞中 m1PK 活性显著升高,Zmin达峰值,smin gF恢复到基础水平。4-Cyano上一M<hylisoqulnollne 和 PD98059不能抑制囊素诱导的杂交瘤细胞m-TPK活性的增力。。RTK一般是通过 RT K-RIS-MAPK途径或队C-PI3K途径发挥作用。抑制试验表明,PLC特异抑制剂U -73 22和PI3K特异抑制剂HeParin均不能抑制囊素诱导的杂交瘤细胞抗体表达和分 泌的增加。说明在杂交瘤细胞囊素信号通路中;n.TPK位于MAPKK的上游,两者 构成一条信号通路。而且这条信号通路,独立于PKA所涉及的信号通路。PKA是一 种第M信使cAMP依赖的酶。有研究报道囊素可提高细胞。AMP水平。Go/Gi群Ga 蛋白特异抑制剂NF023 不能有效抑命]囊素对杂交瘤细胞抗体分泌的促进作用,提示 囊素可能是通过Gs群Ga蛋白来传递信号的。 综上所述,囊素通过激活杂交瘤细胞仅一cAMP-PKA和阿K-Ras-ERK/2信号通 路,在转录水平上协同上调抗体基因的表达,引起抗体分泌的增加。而且这种促杂交 瘤细胞抗体分。必的增力。效应与细胞增殖无关。本研究进一步丰富了抗体生成调控的内 客,并为囊素的临床应用提供了可靠的实验依据。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S852.4

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