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《南京农业大学》 2003年
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猪源链球菌类M蛋白基因的克隆、序列分析、表达及动物免疫试验

范红结  
【摘要】: 马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)和猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)是重要的人兽共患病的病原,能引起猪和人类的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎以及突发性死亡,对养猪业造成巨大的经济损失。马链球菌兽疫亚种表面的类M蛋白(M-like protein)和猪链球菌2型表面的溶菌酶释放蛋白(Muramidase released protein,MRP)是重要的毒力因子和保护性抗原。本文在分子水平对以上毒力因子进行了较系统的研究,并将二者进行了串连表达及猪体免疫试验,为猪链球菌病的防制进行了有益的探索。 1 马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白基因克隆,序列分析及猪源链球菌类M蛋白基因检测 根据已发表的马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)的类M蛋白基因序列,设计和合成一对引物,以猪源马链球菌兽疫亚种ATCC35246株的基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增出类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET-32a(+)中,测定其序列,在GenBank登录,接收号为AY263781。类M蛋白基因含一个完整的开放阅读框,全长为1137bp,编码379个氨基酸残基。经DNA Star软件分析,ATCC35246株类M蛋白基因与马源兽疫亚种W60株、马亚种的类M蛋白基因及A群化脓链球菌的M蛋白基因的同源性分别为86.9%、30.8%、29.4%;推导的氨基酸序列的同源性分别为84.3%、21.9%、23.4%。但ATCC35246株类M蛋白的C末端细胞膜锚定区与M蛋白、马亚种类M蛋白高度同源。用上述设计的引物进行PCR试验,检测34株猪源链球菌类M蛋白基因,发现所有C群猪源链球菌均能检测出类M蛋白基因,而所有猪链球菌(Streptococcus suis)1型和2型菌株及B群、D群链球菌均不能检出类M蛋白基因。 本研究首次克隆了猪源马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白基因,并对该基因进行了序列分析,证实马链球菌兽疫亚种猪源株与马源株有较大差异。 2 猪源马链球菌兽疫亚种9株中国株类M蛋白基因的克隆与序列分析 利用PCR技术,分别扩增国内9省市从1974~2003年分离的马链球菌兽疫亚种类的M蛋白基因,对其进行克隆、测序及序列分析,进而推导其相应的氨基酸序列。结果发现,9分离株中的7株类M蛋白基因片段长度为1 137bp,含一个阅读框,编 猪源链球菌类M基因的克隆、序列分析、表达及动物免疫试验 码379个氨基酸残基,另外两株eG一74一63和Cp一。一04的长度分别为1 143bp及1125bp。 除CP一0104分离株外,8株菌的类M基因的核普酸同源性高达%.9%一99.9%,推导的 相应氨基酸序歹,】同源性高达95.30,0一x00o,o。上述测定的ATCC35246、CC、CxyolZ、 SH0016、CY分离株类M基因序歹.J已被GenBank收录,登录号分别为AY263781、 AY263782、 AY263783、AY263784、AY265990.上述9株猪源株与国外发表的马源 马链球菌兽疫亚种W60株类M基因的核普酸同源性达81.6%一87.0%,推导的相应氛 基酸序列同源性为78.1%一84.3%;猪源株与人源马链球菌兽疫亚种类M基因的核普 酸同源性为81 .7%~91.8%,推导的相应氨基酸序列同源性为76.0%一90.5%. 9株分离株除CP一0104株外,信号肤的序列完全一致,与马源马链球菌兽疚亚种 W60株类M蛋白的信号肤相比,其27、28、30、32位的氨基酸残基分别由S、S、V、 A突变为G、v、A、5.在类M蛋白的C末端,9株分离株的细胞锚定区的序列亦完 全一致,均含有LPSTGE共同的基序.在类M蛋白的高变区,通过比较9株兽疫亚 种分离株推导的类M蛋白的氨基酸序歹,l发现,Al,CC35246、CC、CY、SH0016、CT、 CG一74一63等6株分离株类M蛋白高变区的氨基酸完全一致,其余3株分离株有较小 的差异.其中,CXY012株109位氨基酸残基由L突变为F,143位氨基酸残基由A 突变为E,157位由K突变为E。CW03株第113、116位氨基酸残基由I、K突变为 F、E,第121、127、137、139、140等处由E、Q、R、D、A突变为K、P、H、T、 T.CP一0104与其它猪源链球菌高变区的变异更大,在106、107、111、116、118、121、 122、123等 28处的氨基酸发生T突变,且在126-128、140一146位分别缺失了3个 和6个氛基酸残基。酶切位点分析显示,9株分离株均在524ni处出现Hindln酶切位 点,而人源和马源分离株均没有该酶切位点. 本结果研究表明马链球菌兽疫亚种类M蛋白具有宿主特异性,与马源、人源兽 疫亚种分离株类M蛋白的差异主要在106一1“位氛基酸的高变区及27一32位氨基酸 残基的信号肤。 3马链球菌兽疫亚种10株国内分离株对小鼠免疫效力的评价 取国内10省市分离的10株猪源马链球菌兽疫亚种,分别制备灭活杭原,免疫清 洁级ICR小鼠。小鼠分20组,每组10只,分别用以上10株菌免疫,然后用同源菌 株和ATCC35246株攻击。结果表明,同源菌株攻击,免疫保护率均在90%以上;而 以ATCC35246攻击异源菌免疫的小鼠,免疫保护率为80%一100%.本研究结果表明, 我国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的杭原性差异不大,单一菌株疫苗可用 于不同地区的猪群。 中文摘要 4猪链球菌2型mrP基因免疫功能片段的克隆、表达及动物试验 根据猪链球菌2型(StrePcococcus suis
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S852.4

【引证文献】
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【同被引文献】
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3 李芳;马链球菌兽疫亚种多重PCR检测方法建立及应用[D];南京农业大学;2008年
4 陈国强;猪链球菌2型江苏分离株溶血素的产生条件、提纯和特性分析[D];南京农业大学;2000年
5 郭会田;两种链球菌生物学特性及其与猪血清白蛋白黏附的研究[D];华中农业大学;2008年
6 石建;猪霍乱沙门氏菌—猪链球菌三联基因工程疫苗研究[D];华中农业大学;2009年
7 李明;猪链球菌2型MRP与EPF部分片段串联表达与免疫原性及检测两种猪源链球菌抗体间接ELISA方法的建立与应用[D];南京农业大学;2005年
8 千国胜;猪链球菌2型与胶原蛋白的黏附作用[D];华中农业大学;2008年
9 高尚庆;猪链球菌2型生物学特性研究及蜂胶佐剂灭活疫苗的研制[D];吉林大学;2007年
10 王建;猪链球菌病疫苗的研制[D];南京农业大学;2001年
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